曾 燕

（邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院藥劑科，湖南 邵陽(yáng) 422000）

外科胸腹部大血管手術(shù)后，由于缺血－再灌注引起的脊髓損傷仍存在較高風(fēng)險(xiǎn)[1－2]。如何預(yù)防和治療圍手術(shù)期的脊髓缺血－再灌注損傷已成為研究的重要課題。目前，低溫已廣泛應(yīng)用于外科大血管手術(shù)中中樞神經(jīng)組織的保護(hù)[3－4]，也是簡(jiǎn)單、有效的神經(jīng)保護(hù)措施。腺苷是腺嘌呤核苷酸的代謝產(chǎn)物，普遍分布在細(xì)胞內(nèi)外。Koichi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腺苷可通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)和神經(jīng)再生而對(duì)脊髓損傷起保護(hù)作用。但低溫聯(lián)合腺苷治療脊髓損傷的報(bào)道極少，其具體的作用機(jī)制也尚不清楚。本研究通過(guò)建立大鼠脊髓缺血－再灌注模型，用低溫聯(lián)合腺苷的處理方法，觀察其是否對(duì)脊髓缺血－再灌注損傷有保護(hù)作用，以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物及分組：選擇成年健康雄性SD大鼠27只，SPF級(jí)，體重（200±20）g，由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為湘醫(yī)動(dòng)字D20－013號(hào)，室溫18～20℃，濕度65% ～70%，均自由飲水進(jìn)食。隨機(jī)分為3組，各9只。低溫處理組(A組)，腹主動(dòng)脈阻斷90 min，術(shù)中全身低溫18℃維持；常溫腺苷手術(shù)組(B組)，夾閉前 10 min尾靜脈注射腺苷，劑量為 0．06 mL／100 g，質(zhì)量濃度為5 g／L，腹主動(dòng)脈阻斷 90 min；腺苷 ＋低溫18℃處理組(C組)，分離腹主動(dòng)脈，夾閉前10 min尾靜脈注射腺苷，劑量為0．06 mL ／100 g，質(zhì)量濃度為 5 g／L，至 18 ℃ 維持，腹主動(dòng)脈阻斷90 min。

主要材料：抗兔 Caspase－12、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP－78）抗體（Abcam公司），免疫組化試劑盒；TUNEL試劑盒。

1．2 試驗(yàn)方法

大鼠脊髓缺血－再灌注模型建立：腹腔注射（每100 g體重0．3 mL）10%水合氯醛麻醉大鼠成功后，仰臥位固定于試驗(yàn)臺(tái)上，腹部備皮消毒切開(kāi)，于左腎動(dòng)脈分叉下鈍性分離并顯露出近端1 cm腹主動(dòng)脈，左右髂總動(dòng)脈分叉上鈍性分離并顯露遠(yuǎn)端1 cm腹主動(dòng)脈，尾靜脈注射（每 100 g體重0．1 mL）肝素（濃度為500 U／mL）5 min后，用小號(hào)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈近端及遠(yuǎn)端，夾閉90 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾行再灌注，縫合切口。

溫度監(jiān)測(cè)：用數(shù)字式電子肛溫計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠肛溫。手術(shù)過(guò)程中以普通100 W燈泡照射保溫，使肛溫維持在37℃左右。低溫處理組分離腹主動(dòng)脈后用自制冰盒降溫將大鼠肛溫降至18℃，阻斷90 min內(nèi)維持18℃，松夾后用普通100 W燈泡照射復(fù)溫至37℃左右。

脊髓組織取材：預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，一部分大鼠在麻醉下開(kāi)胸暴露心臟，剪開(kāi)左心室插入灌注針頭至升主動(dòng)脈，用止血鉗固定，剪開(kāi)右心房，快速灌注生理鹽水(室溫)100～150 mL，待血液沖洗干凈后(肝臟變白)，即灌注 4%多聚甲醛（4℃）500 mL。背部備皮，將皮膚剪開(kāi)，用咬骨鉗將棘突咬掉，暴露脊髓，取出腰骶段脊髓，行石蠟包埋，常規(guī)HE染色。

運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分：由2名不了解分組情況的觀察者評(píng)估和記錄評(píng)分，每例均測(cè)試3次，取其平均值，分別于再灌注后6，24，48 h評(píng)估動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)狀況。參照改良Tarlov標(biāo)準(zhǔn)對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，0級(jí)為后肢無(wú)活動(dòng)，不能負(fù)重；1級(jí)為后肢可見(jiàn)活動(dòng)，但不能負(fù)重；2級(jí)為后肢活動(dòng)頻繁或有力，不能負(fù)重；3級(jí)為后肢可支持體重，能走1～2步；4級(jí)為可行走，僅有輕度障礙；5級(jí)為行走功能正常。

免疫組織化學(xué)顯色：石蠟切片3%H2O2室溫90 s，正常動(dòng)物血清封閉 20 min，1∶200兔抗鼠 Caspase－12孵育過(guò)夜，4℃；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃，2 h；鏈霉素－親和素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC 復(fù)合物)，37℃，1 h；每次換液前均用 0．01 mol／L PBS沖洗5 min×3次，DAB加硫酸鎳顯色，常規(guī)脫水，封片。陽(yáng)性細(xì)胞為紫藍(lán)色，光鏡下觀察，計(jì)錄陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量；并用圖像分析系統(tǒng)(成都金盤(pán)多媒體圖像處理系統(tǒng))測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。

TUNEL染色：石蠟切片蛋白酶K消化60 min，3%H2O2－甲醇液50 μL 阻斷內(nèi)源型過(guò)氧化物酶，室溫 10 min；0．1%TritonX －100冰浴 5 min；TUNEL 反應(yīng)液 50 μL，37 ℃消化 60 min； POD 50 μL；每次換液前均用PBS沖洗5 min×3次；DAB加硫酸鎳顯色，脫水，封片。凋亡神經(jīng)細(xì)胞核呈深淺不一的紫黑色顆粒狀。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 HE 染色

經(jīng)常規(guī)HE染色后，各組均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，尤以常溫手術(shù)對(duì)照組為甚，凋亡細(xì)胞核濃縮碎裂，染色加深，大小不一致，或呈現(xiàn)大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜包繞，即凋亡小體，有或無(wú)胞質(zhì)濃縮。A組神經(jīng)元腫脹，胞漿淡染，局部充血水腫，尼氏體淡染，排列紊亂；B組、C組神經(jīng)元改變較A組輕；C組神經(jīng)元有一定程度損傷，但較B組明顯減輕，充血和水腫也減輕，尼氏體排列較規(guī)則。

2．2 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果

分別對(duì)各組大鼠再灌注6，12，24 h的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。與A組相比，B組、C組各時(shí)間點(diǎn)后肢功能評(píng)分降低幅度減少（P＜0．01）；相對(duì)于 B組，C組各時(shí)間點(diǎn)術(shù)后評(píng)分明顯增高（P ＜ 0．01）。見(jiàn)表 1。

2．3 TUNEL 染色結(jié)果

各組均出現(xiàn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)亡，細(xì)胞核呈深蘭色，神經(jīng)元呈圓形或三角形，主要分布于前角和中央管周?chē)?，部分?xì)胞可見(jiàn)核固縮，深染，位于細(xì)胞一側(cè)；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡分布廣泛，但主要位于鄰近灰質(zhì)的白質(zhì)部分。再灌注后，B組、C組凋亡細(xì)胞少于A組，且B組凋亡細(xì)胞數(shù)多于C組。

表1 3組 Tarlov評(píng)分結(jié)果(，分，n＝9)

表1 3組 Tarlov評(píng)分結(jié)果(，分，n＝9)

注：與A組同時(shí)點(diǎn)比較， P＜0．01；與B組同時(shí)點(diǎn)比較，＃P＜0．01。

組別A組B組C組術(shù)前5．0 5．0 5．0術(shù)后6 h 0．18 ± 0．15＃1．12 ± 0．13 1．55 ±0．12 ＃12 h 0．78 ± 0．13＃1．65 ± 0．11 2．01 ±0．05 ＃24 h 1．53 ± 0．05＃2．17 ± 0．01 2．56 ±0．18 ＃

2．4 免疫組織化學(xué)

在光鏡下觀察，陰性對(duì)照未見(jiàn)細(xì)胞染色。各組在脊髓缺血再灌注后均有神經(jīng)元 Caspase－12和GRP－78表達(dá)，A組脊髓Caspase－12陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，著色更深；B組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，C組僅有少量陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；A組脊髓GRP－78陽(yáng)性表達(dá)較B組、C組少，著色淺；C組陽(yáng)性表達(dá)高于 B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表2。

表2 大鼠脊髓缺血－再灌注后免疫組織化學(xué)變化結(jié)果（，n＝9）

表2 大鼠脊髓缺血－再灌注后免疫組織化學(xué)變化結(jié)果（，n＝9）

注：與 A 組比較， P ＜0．05；與 B 組比較，＃P ＜0．05。

項(xiàng)目平均光密度值積分光密度值組別A組B組C組A組B組C組Caspase－12 0．42 ± 0．10＃0．31 ± 0．12 0．14 ±0．08 ＃238．11 ± 113．26＃176．35 ± 25．27 86．65 ±43．56 ＃GRP－78 0．15 ± 0．01＃0．46 ± 0．13 0．61 ±0．32 ＃98．65 ± 25．12＃252．18 ± 33．14 425．64 ±85．32 ＃

3 討論

脊髓缺血損傷形式有2種，即瞬時(shí)的損傷和延遲的損傷，前者常常是由于急性的缺血損傷所造成的神經(jīng)細(xì)胞壞死，后者則多是由于細(xì)胞凋亡所引起[6]。GRP－78是細(xì)胞為了適應(yīng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）所產(chǎn)生的一類(lèi)應(yīng)激蛋白，屬于HSP70基因家族，其生理功能是協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配。Caspase－12是caspase家族中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白，是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。目前已有研究報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而參與腦和脊髓缺血－再灌注損傷[7]。腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸傳遞和神經(jīng)元活動(dòng)的重要抑制性調(diào)節(jié)因子之一，體外腺苷發(fā)揮作用可通過(guò)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞2種形式。研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用腺苷受體激動(dòng)劑能改善脊髓缺血－再灌注損傷[8]。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道，低溫能減少Caspase－12蛋白在缺血梗死區(qū)域的編碼表達(dá)[9]。且藥物與低溫聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)比單獨(dú)用藥效果更好[10－11]。以上現(xiàn)象提示，低溫可能加強(qiáng)了藥物的保護(hù)效果或者拓寬了藥物的治療范圍[12]。

本試驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示，B組、C組大鼠脊髓缺血再－灌注損傷后的局部缺損區(qū)域，缺血壞死等改變比A組輕，且C組改變比B組輕，細(xì)胞殘留數(shù)目增多，形態(tài)大致正常；行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，各組時(shí)間點(diǎn)，B組、C組高于A組，且 B組低于 C組；TUNEL染色結(jié)果顯示，再灌注后，B組、C組凋亡細(xì)胞少于A組，且B組凋亡細(xì)胞數(shù)多于C組，提示低溫聯(lián)合腺苷對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞缺血－再灌注損傷有保護(hù)作用，且比單獨(dú)應(yīng)用低溫或腺苷更有效。

本試驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，各組在脊髓缺血－再灌注后均有神經(jīng)元 Caspase－12和 GRP－78表達(dá)，A組脊髓 Caspase－12陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，著色更深；B組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，C組僅有少量陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)；A組脊髓 GRP－78陽(yáng)性表達(dá)較 B組、C組少，著色淺；C組陽(yáng)性表達(dá)高于B組。說(shuō)明在脊髓缺血－再灌注中低溫聯(lián)合腺苷保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)降低Caspase－12和上調(diào)GRP－78的表達(dá)來(lái)減少脊髓神經(jīng)組織的損傷。

綜上所述，本試驗(yàn)證實(shí)了低溫聯(lián)合腺苷對(duì)于脊髓缺血－再灌注損傷有保護(hù)作用，并且低溫可能加強(qiáng)了腺苷的保護(hù)效果，其可能是通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)對(duì)脊髓神經(jīng)組織的保護(hù)。進(jìn)一步證實(shí)了低溫結(jié)合藥物是一種更有效的治療方法，為治療脊髓缺血－再灌注損傷提供了新的治療途徑，但其具體的分子作用機(jī)制及臨床應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

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