繆 靜 殷曰彩 馮志彬 程仕偉

MAO Jing YIN Yue－cai FENG Zhi－binCHENG Shi－wei

（魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

（College of Life Science，Ludong University，Yantai，Sandong 264025，China）

無花果果實(shí)皮薄無核，肉質(zhì)松軟，風(fēng)味甘甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的18種氨基酸，尤以抗疲勞的天門冬氨酸（1.9%干重）含量最高，另外，維生素 A、E、C及硒、鋅、鈣等礦物質(zhì)含量也極其豐富［1］。無花果具有較高的藥用價(jià)值，中醫(yī)學(xué)［2］認(rèn)為，具有滋養(yǎng)、健脾、開胃、清熱、潤(rùn)腸、解毒、消腫、降血壓等功效；無花果還含有大量的膳食纖維、果膠等成分，可驅(qū)除人體內(nèi)的鉛，降低膽固醇和血糖，對(duì)心、腦血管硬化及糖尿病具有治療作用，還可降低肝臟中的酯質(zhì)含量，對(duì)脂肪肝有一定的療效［2－4］。本研究采用成熟無花果為材料，此時(shí)果實(shí)含糖量及枸櫞酸等有機(jī)酸含量最高，有利于微生物的生長(zhǎng)及提高出醋率。

無花果果醋的研究論文、專利及產(chǎn)品雖然有見出現(xiàn)，但是數(shù)量很少，且工藝條件的優(yōu)化也僅僅做了單因素及正交試驗(yàn)［5］。Design Expert軟件在質(zhì)量控制、管理和科研領(lǐng)域應(yīng)用較多，但在果醋培養(yǎng)條件優(yōu)化方面的研究未見報(bào)道。本研究擬利用Design Expert軟件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)無花果醋的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

活性干酵母：湖北安琪生物集團(tuán)；

醋酸菌：魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏。

1.1.2 原料和試劑

無花果：煙臺(tái)產(chǎn)；

蔗糖：食品級(jí)，市購(gòu)；

果膠酶：2萬U／g，諾維信酶制劑公司；

酵母粉、蛋白胨、瓊脂：生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；

水楊酸、酒石酸鉀鈉、NaOH：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備

旋轉(zhuǎn)式搖床：HZQ－Q型，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：Agilent 8453型，安捷倫科技公司上海分公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH－280型，廣東省醫(yī)療器械廠；

高壓滅菌鍋：LS－C50L型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；

發(fā)酵罐：5BGZ－2002型，上海保興生物工程設(shè)備公司；

手持糖度計(jì)：VBR90A型，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 酵母菌活化 用2%（m／V）的葡萄糖加入1%（m／V）安琪活性干酵母，敞開，30℃下連續(xù)攪拌，活化約30 min，直至糖水中出現(xiàn)大量微小氣泡［6］。

1.2.3 酒精發(fā)酵 將無花果鮮果破碎榨汁后，調(diào)整果汁中還原糖含量至17%（m／V）左右，接入活化的酵母菌，于26℃發(fā)酵。酒精發(fā)酵過程中測(cè)定酒精度，當(dāng)酒精度達(dá)到7%（V／V）左右時(shí)，終止酒精發(fā)酵轉(zhuǎn)入醋酸發(fā)酵［7，8］。

1.2.4 醋酸發(fā)酵 將100 m L無花果酒液裝入500 m L三角瓶，接入醋酸菌，置于旋轉(zhuǎn)搖床在一定溫度和轉(zhuǎn)速下發(fā)酵，每隔12 h測(cè)酸度一次，至酸度不再上升時(shí)結(jié)束發(fā)酵［9，10］。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 選取轉(zhuǎn)速、溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，并選取對(duì)無花果醋發(fā)酵影響較大的因素做下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。在溫度為32℃，接種量5%，發(fā)酵5 d的條件下，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速分別為160，180，200，220，240 r／min進(jìn)行醋酸發(fā)酵確定最適轉(zhuǎn)速；在轉(zhuǎn)速為200 r／min，接種量5%，發(fā)酵5 d的條件下，分別于28，30，32，34，36℃進(jìn)行醋酸發(fā)酵確定最佳發(fā)酵溫度；在溫度為32℃，轉(zhuǎn)速200 r／min，發(fā)酵5 d的條件下，采用3%，5%，7%，9%，11%的接種量進(jìn)行果醋發(fā)酵選擇最有利于果醋發(fā)酵的接種量；在溫度為32℃，接種量5%，轉(zhuǎn)速200 r／min的條件下，分別在果醋發(fā)酵的第3、5、7及9天取樣測(cè)定醋酸濃度確定果醋最佳發(fā)酵周期。過程中以醋酸濃度和轉(zhuǎn)化率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.6 優(yōu)化試驗(yàn) 采用Box－Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析，對(duì)無花果醋發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化［11，12］。

1.2.7 測(cè)定方法

（1）總酸：采用NaOH滴定法；

（2）揮發(fā)酸：采用蒸餾法；

（3）酒精度：采用重鉻酸鉀比色法；

（4）糖度：用糖度計(jì)測(cè)定；

（5）還原糖（以葡萄糖計(jì)）：采用水楊酸試劑比色法［10］。

（6）醋酸轉(zhuǎn)化率：按式（1）計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化無花果醋發(fā)酵工藝

2.1.1 轉(zhuǎn)速對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響 氧氣為醋酸菌生長(zhǎng)繁殖及醋化乙醇所必需，培養(yǎng)系統(tǒng)的溶氧量將直接影響醋酸的發(fā)酵，在搖瓶裝液量一定的情況下系統(tǒng)溶氧主要受搖床轉(zhuǎn)速的影響［10］，隨著轉(zhuǎn)速的增加溶氧會(huì)隨之增加。由圖1可知，搖床轉(zhuǎn)速為200 r／min時(shí)醋酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率最高，過高或過低的轉(zhuǎn)速均不利于醋酸發(fā)酵。這主要是因?yàn)榇姿峋L(zhǎng)及醋酸的合成均需要大量氧氣的參與，過低的溶氧抑制了醋酸菌的生長(zhǎng)并影響反應(yīng)的正常進(jìn)行，過高的轉(zhuǎn)速雖然會(huì)增加發(fā)酵液中氧氣含量，但也會(huì)導(dǎo)致底物乙醇的揮發(fā)耗損，同時(shí)伴隨產(chǎn)生過高的剪切力也不利用醋酸菌的生長(zhǎng)。

圖1 轉(zhuǎn)速對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響Figure 1 Effects of rotate speed on fig vinegar fermentation

2.1.2 溫度對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響 溫度影響菌體代謝合成速率及酶的活性［6］。由圖2可知，在28～32℃時(shí)，醋酸菌代謝速度加快，醋酸產(chǎn)量隨溫度上升而增加，在32℃時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量，之后逐漸降低，在36℃時(shí)產(chǎn)量最低，可能是高溫不利于醋酸菌的生長(zhǎng)，并造成菌體內(nèi)部分酶失活，影響醋酸的合成。

圖2 溫度對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響Figure 2 Effects of temperature on fig vinegar ermentation

2.1.3 接種量對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響 由圖3可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)接種量對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響不大，除3%接種量產(chǎn)量略低外，其它試驗(yàn)組醋酸產(chǎn)量均在40 g／L以上，其中以5%（m／V）接種量醋酸產(chǎn)量最高。分析發(fā)酵液中的酒精含量，3%（m／V）接種量酒精殘留量較高，適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵周期亦能獲得較高的產(chǎn)量，這也說明接種量對(duì)發(fā)酵周期有一定的影響，較小的接種量會(huì)延長(zhǎng)醋酸的發(fā)酵周期。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響 由圖4可知，發(fā)酵3 d時(shí)酒精醋化過程尚未完成，醋酸產(chǎn)量?jī)H約為完全醋化時(shí)的60%左右，5～7 d時(shí)醋酸產(chǎn)量波動(dòng)不大，發(fā)酵基本結(jié)束，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間醋酸含量沒有明顯增加，故無花果醋的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)以5～7 d為宜。

圖3 接種量對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響Figure 3 Effects of inoculation volume on fig vinegar fermentation

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)無花果醋發(fā)酵的影響Figure 4 Effects of time on fig vinegar fermentation

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化無花果醋發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇可能形成曲面且對(duì)產(chǎn)量影響較大的3個(gè)因素（轉(zhuǎn)速、溫度、接種量），根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)原理以無花果醋中醋酸含量為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平編碼值見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Variables and levels in the three－variable／threelevel response surface design

利用Design Expert軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Arrangment and results of the three－variable／three－levels central composite design

表3 回歸模型各項(xiàng)的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

表3的方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著，并且該模型的決定系數(shù)R2＝0.985，響應(yīng)值的變化有98.5%來源于所選因素，僅有1.5%的綜合指標(biāo)總變異不能由該模型解釋，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。失擬項(xiàng)P＝0.086 5＞0.05，表明方程模型失擬不顯著，說明回歸方程能很好的描述發(fā)酵參數(shù)與醋酸含量的關(guān)系。各變量P＜0.05時(shí)說明其對(duì)模型作用顯著，由P值大小可知，在所選各因素的水平范圍內(nèi)對(duì)醋酸產(chǎn)量影響均極其顯著。

圖5 轉(zhuǎn)速和溫度交互影響醋酸產(chǎn)量的曲面圖及等高線圖Figure 5 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of rotate speed and temperature on vinegar production

圖6 轉(zhuǎn)速和接種量交互影響醋酸產(chǎn)量的曲面圖及等高線圖Figure 6 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of rotate speed and inoculation volume on vinegar production

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化 通過上述二次多項(xiàng)回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖5～7。通過該組動(dòng)態(tài)圖即可對(duì)任何兩因素的交互影響醋酸產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，從中確定最佳因素水平范圍。由圖5～7可知，轉(zhuǎn)速和溫度對(duì)醋酸產(chǎn)量影響顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，隨著二者的增減，醋酸產(chǎn)量變化較大，接種量對(duì)醋酸產(chǎn)量影響較小，曲線表現(xiàn)較為平緩。通過軟件綜合分析，得出醋酸濃度的最大估計(jì)值為52.07 g／L，與之對(duì)應(yīng)的自變量實(shí)際值為轉(zhuǎn)速220 r／min，溫度33℃，接種量5.39%。

圖7 溫度和接種量交互影響醋酸產(chǎn)量的曲面圖及等高線圖Figure 7 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of temperature and inoculation volume on vinegar production

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以2.2.2確定的最佳條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，無花果醋酸平均含量達(dá)到52 g／L，與目前成品果醋的酸度（50～60 g／L）相當(dāng)［13］，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，可見該模型能較好的預(yù)測(cè)無花果醋的發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面分析法對(duì)無花果醋發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速220 r／min、溫度33℃、接種量5.39%，在此條件下，醋酸含量可達(dá)52 g／L。經(jīng)方差分析得知轉(zhuǎn)速和溫度對(duì)無花果醋的發(fā)酵影響是顯著的，接種量影響較不明顯。另外，驗(yàn)證值同回歸方程所得到的最大預(yù)測(cè)值非常接近，說明回歸方程能較真實(shí)的反應(yīng)篩選因素的影響，建立的模型與實(shí)際情況吻合度較高，因此用響應(yīng)面法優(yōu)化無花果醋的培養(yǎng)條件是有效可行的。下一步可以在發(fā)酵罐中進(jìn)行優(yōu)化，從而為無花果醋的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

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