徐曉臣，趙冉冉，徐 飛，李彥改，陳朝旺，檀國(guó)軍

(1.邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市第一醫(yī)院泌尿科，河北 邯鄲 056002；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050071)

·論 著·

α-硫辛酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠脊髓組織IL-17表達(dá)的影響

徐曉臣1，趙冉冉2，徐 飛3，李彥改1，陳朝旺2，檀國(guó)軍4

(1.邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市第一醫(yī)院泌尿科，河北 邯鄲 056002；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050071)

目的研究α-硫辛酸(Alpha-lipoic acid，ALA)對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型中脊髓組織IL-17表達(dá)的影響。方法健康雌性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)，EAE 7 d組(EAE-7 d組)、EAE 6個(gè)月病程組(EAE-6 m組)、硫辛酸急性期組(ALA-7 d組)和硫辛酸6個(gè)月病程組(ALA-6 m組)。HE染色觀察病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色觀察IL-17的表達(dá)變化。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，在α-硫辛酸治療急性期組和6個(gè)月病程組，均可減輕脊髓組織的炎性反應(yīng)和髓鞘損傷。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，EAE-7 d組大鼠IL-17蛋白的表達(dá)比正常對(duì)照組增加(P＜0.01)；EAE-6 m組大鼠IL-17蛋白的表達(dá)比正常對(duì)照組增加(P＜0.01)；α-硫辛酸處理后急性期組和6個(gè)月病程組IL-17蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論α-硫辛酸在EAE大鼠模型中的保護(hù)作用可能是通過抑制IL-17的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

多發(fā)性硬化；α-硫辛酸；炎癥；IL-17

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)和實(shí)驗(yàn)性自身變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動(dòng)物模型，都是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性和脫髓鞘改變?yōu)椴±硖卣鞯募膊?，?duì)自身髓鞘的免疫反應(yīng)參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程，其中。近年來研究發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸(Alpha-lipoic acid，ALA)在EAE模型中具有保護(hù)作用[1]，但其發(fā)揮治療作用的機(jī)制還不明確，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)ALA有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖從而抑制自身免疫的作用[2]。本研究應(yīng)用大鼠EAE模型觀察ALA對(duì)脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和IL-17表達(dá)的影響，探討ALA對(duì)EAE保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar大鼠50只，8周齡，體重(190±10)g；清潔級(jí)豚鼠3只，體重(370±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 α-硫辛酸(Sigma公司)，卡介苗(北京生物制品研究所)，兔抗多克隆抗體IL-17(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡RM2015)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BX51T-PHD-J11)。

1.3 動(dòng)物模型的建立 3只健康豚鼠用水合氯醛350 mg/kg麻醉，快速取脊髓，去除脊膜稱重后，按照脊髓重量與冰鹽水體積為1:10的比例制成豚鼠脊髓勻漿，并與等量含6 mg/ml卡介苗的完全福氏佐劑混合，在冰上抽打制備成油包水乳劑，為完全免疫抗原。分別于大鼠四肢足墊及背部皮下5個(gè)部位注射抗原勻漿(0.5 ml/只)，從而建立EAE大鼠模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 健康雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為五組：對(duì)照組(NC組)、EAE 7 d組(EAE-7 d組)、EAE 6個(gè)月病程組(EAE-6 m組)、α-硫辛酸急性期組(ALA-7 d組)和α-硫辛酸6個(gè)月組(ALA-6 m組)，每組各10只。ALA-7 d組和ALA-6 m組自第一次發(fā)病起給予藥物腹腔注射，連續(xù)注射7 d(100 mg·kg-1·d-1)。

1.5 HE染色及免疫組織化學(xué)檢查 磷酸鹽緩沖液(PBS)和4%多聚甲醛灌注大鼠后，取脊髓，石蠟包埋，常規(guī)切片，行HE染色及免疫組織化學(xué)IL-17染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。對(duì)IL-17免疫組化應(yīng)用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值(Average optical density，AOD)，以AOD值代表目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，AOD數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用ANOVA，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 EAE-7 d組大鼠脊髓組織內(nèi)可見明顯單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞樣浸潤(rùn)，血管周圍有明顯炎性浸潤(rùn)，神經(jīng)元髓鞘稀疏，ALA-7 d組比EAE-7 d組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，髓鞘結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，EAE-6m組大鼠脊髓組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分髓鞘稀疏，ALA-6 m組較EAE-6 m組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，髓鞘結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，見圖1。

圖1 大鼠脊髓病理改變（HE染色，400×）

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 NC組、EAE-7 d組、ALA-7 d組、EAE-6 m組和ALA-6 m組五組大鼠脊髓陽(yáng)性細(xì)胞AOD值分別為(0.23±0.01)、(0.52±0.04)、 (0.38±0.03)、(0.48±0.06)、(0.39±0.04)，IL-17蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.13，P＜0.01)，見圖2。EAE-7 d組IL-17蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組增加118%，EAE-6 m組IL-17蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組增加100% (t=3.85，P＜0.01)。α-硫辛酸處理后急性期組和6個(gè)月病程組IL-17蛋白的表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)為ALA-7 d組IL-17蛋白免疫反應(yīng)強(qiáng)度的AOD值比EAE-7 d組降低33%(t=2.65，P＜0.01)；ALA-6 m組大鼠IL-17蛋白免疫反應(yīng)強(qiáng)度的AOD值比EAE-6 m組降低了22%(t=3.98，P＜0.01)。

圖2 各組大鼠脊髓IL-17陽(yáng)性細(xì)胞AOD值

3 討論

EAE模型很好的模擬了MS的病理過程，其神經(jīng)功能評(píng)分、組織病理學(xué)、特異性T細(xì)胞增殖及其炎性細(xì)胞因子的反應(yīng)等方面符合MS的發(fā)病[3-4]，廣泛應(yīng)用于MS的實(shí)驗(yàn)研究。MS的發(fā)病由多種機(jī)制參與，IL-17在MS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用，IL-17/IL-23軸目前被認(rèn)為是MS最重要的治療靶點(diǎn)。IL-17作為前炎性細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖和分化、生物因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮了重要作用[5]。研究表明，IL-17在MS患者外周血單核細(xì)胞表達(dá)數(shù)量高于健康對(duì)照組，且表達(dá)水平增高與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)[6]，應(yīng)用抑制IL-17活性的藥物能夠減輕EAE病情嚴(yán)重程度[7]。

MS可侵犯大腦、小腦、腦干、視神經(jīng)及脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個(gè)部位。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的病變主要表現(xiàn)為脫髓鞘和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，造成局部能量代謝障礙，ATP含量減少，使神經(jīng)通透性增加、組織液含量增加，導(dǎo)致軸漿內(nèi)水含量增多，最終造成軸突腫脹和髓鞘的松解，IL-17在上述病理過程中可能發(fā)揮了重要作用。

α-硫辛酸(Alpha-lipoicAcid，ALA)為維生素類藥物，也是一種強(qiáng)抗氧化劑，主要通過清除自由基和活性氧、螯合金屬離子、再生其他內(nèi)源性抗氧化劑而發(fā)揮其抗氧化作用[8]，在細(xì)胞和動(dòng)物模型中證實(shí)具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)[9]、神經(jīng)保護(hù)[10]、保護(hù)血腦屏障[11]、改善認(rèn)知[12]、調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺含量[13]、保護(hù)線粒體[14]等作用，作為神經(jīng)保護(hù)劑已被應(yīng)用于多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的防治[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，EAE-7 d組大鼠和EAE-6 m組大鼠脊髓前角細(xì)胞有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)稀疏，EAE-7 d組大鼠的炎性浸潤(rùn)和髓鞘結(jié)構(gòu)損傷比EAE-6 m組要嚴(yán)重，提示豚鼠脊髓勻漿注射成功制作大鼠EAE模型，在急性期和半年期均存在有較強(qiáng)的炎性浸潤(rùn)和神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)的損壞，ALA-7 d組大鼠和ALA-6 m組大鼠的炎性浸潤(rùn)、神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)較相應(yīng)的對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)，提示α-硫辛酸對(duì)EAE短期和長(zhǎng)期病程中存在的脊髓炎性浸潤(rùn)和髓鞘損傷有明顯的改善作用。此外，通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)IL-17蛋白在EAE-7 d組大鼠和EAE-6 m組大鼠脊髓表達(dá)明顯升高，α-硫辛酸治療組IL-17的表達(dá)顯著降低，提示EAE病程中在急性期和半年期均存在有較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，α-硫辛酸治療后其炎癥反應(yīng)明顯減輕。上述結(jié)果提示：α-硫辛酸可能通過抑制IL-17的表達(dá)和減輕EAE大鼠模型脊髓的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，大鼠發(fā)病急性期及半年時(shí)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存在炎癥反應(yīng)、脫髓鞘損傷，α-硫辛酸處理大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)、脫髓鞘損傷明顯減輕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的機(jī)制及多發(fā)性硬化的防治提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of alpha-lipoic acid on IL-17 expression in rats with experimental allergic encephalomyelitis.

XU Xiao-chen1,ZHAO Ran-ran2,XU Fei3,LI Yan-gai1,CHEN Chao-wang2,TAN Guo-jun4.

1.Department of Neurology, the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA;2.Department of Emergency,the First Hospital of Handan, Handan 056002,Hebei,CHINA;3.Department of Urology,the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA; 4.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050071,Hebei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of alpha-lipoic acid(ALA)on IL-17 expression in rats with experimental allergic encephalomyelitis(EAE).MethodsFifty female Wistar rats were divided randomly into five groups:the normal control group(NC group),EAE model group with 7 days(EAE-7 d group),EAE model group with 6 months(EAE-6 m group),ALA administrated EAE model group with 7 days(ALA treated EAE-7 d group), ALA administrated EAE group with 6 months(ALA treated EAE-6 m group).HE staining was used to detect the pathologic changes.Immunohistochemistry was used to detect the expression of IL-17.ResultsHE staining showed that,in alpha-lipoic acid treated groups(ALAtreated EAE-7 d group,ALAtreated EAE-6 m group),inflammatory reaction and myelin damage were all relieved.According to immunohistochemistry,the expression of IL-17 in EAE-7 d group and in EAE-6 m group was significantly increased compared to NC group(P＜0.01).However,the expression of IL-17 in alpha-lipoic acid treated groups significantly decreased compared with EAE-7 d group and EAE-6 m group respectively(P＜0.01).ConclusionAlpha-lipoic acid may exert its neuroprotective effect through ameliorating inflammative reacts.

Mutiple sclerosis;Alpha-lipoic acid;Inflammation;IL-17

R-332

A

1003—6350（2014）24—3589—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1403

2014-08-07)

河北省科技廳課題（編號(hào)：11276425）

檀國(guó)軍。E-mail：ttguojun@hotmail.com