林春華，唐 蜜，陳 旻，劉 曼，桑 娜

（湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

林春華，唐 蜜，陳 旻，劉 曼，桑 娜

（湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

目的分析磷酸化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(P-VEGFR-3)、磷酸化的蛋白激酶(P-AKT)、磷酸化的血小板源性生長(zhǎng)因子α受體(P-PDGFR-α)及淋巴內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜炎癥性疾病中的蛋白表達(dá)差異，以探討其臨床檢測(cè)價(jià)值。方法對(duì)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜炎癥性疾病患者的石蠟組織標(biāo)本各25例進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀(guān)察P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽(yáng)性表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組之間的差異性，等級(jí)資料和率的比較分別采用Riddit分析及Fisher檢驗(yàn)。結(jié)果有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織，且無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織，各指標(biāo)的組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但子宮內(nèi)膜不典型增生和炎癥性疾病組織之間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論P(yáng)-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，臨床上可作為其發(fā)病和預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

磷酸化的血小板源性生長(zhǎng)因子α受體；磷酸化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3；磷酸化的蛋白激酶磷酸化的血小板源性生長(zhǎng)因子α受體；淋巴內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40；子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌為婦產(chǎn)科臨床最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，子宮內(nèi)膜癌的治療研究雖取得了一定進(jìn)展，但其5年生存率仍無(wú)明顯改善。影響其術(shù)后生存率的主要因素之一是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的各項(xiàng)分子標(biāo)記物得到廣大學(xué)者的重視，由此開(kāi)展了以各項(xiàng)標(biāo)記物為靶點(diǎn)的腫瘤生物療法的研究。血小板源性生長(zhǎng)因子α受體(Platelet derived growth factor receptor α，PDGFR-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(Vascular endothelial growth factor，VEGFR-3)、蛋白激酶(Threonine kinase，AKT)及D2-40為近年腫瘤生物治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-4]，其中前三者以磷酸化為主要激活形式。各因子在生殖、內(nèi)分泌及消化系腫瘤的研究中均取得了一定進(jìn)展，但其在子宮內(nèi)膜癌中的研究較為鮮見(jiàn)，國(guó)內(nèi)尚處于起步階段。本研究對(duì)子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜炎癥性疾病的組織切片進(jìn)行免疫組化研究，以探討P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40對(duì)子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 石蠟組織標(biāo)本收集于本院2008年6月至2013年3月收治的子宮內(nèi)膜病變患者，患者均于就診時(shí)刮取子宮內(nèi)膜組織，制備石蠟切片。根據(jù)患者的病理情況分為4組：A組為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌；B組為無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌；C組為子宮內(nèi)膜不典型增生；D組為子宮內(nèi)膜炎性病變；各組均為25例。

1.2 觀(guān)察指標(biāo) 顯微鏡下觀(guān)察P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度。

1.3 檢測(cè)方法 采用DAKO公司的ELPS法(En-Vision兩步法免疫組化試劑盒)，主要步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：①常規(guī)脫蠟至水，以PBS沖洗3次×5 min，微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)(中火10 min)，流水自然冷卻后PBS沖洗3次×5 min。②以3.0%的H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，每張切片1滴，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次×5 min。③一抗孵育，每張切片滴加一抗稀釋液1滴，室溫孵育150 min，PBS沖洗3次×5 min。④分別滴加試劑A和試劑B，試劑A孵育20 min，試劑B孵育30 min，每次孵育完畢PBS沖洗3次×5 min。⑤配置DBA液，滴于切片，顯微鏡下觀(guān)察，確認(rèn)抗體孵育成功后蘇木素復(fù)染，制備中性樹(shù)膠封片，電鏡下觀(guān)察。一抗Anti-phospho-PDGF Receptor alpha(ab79318；1:500)與Anti-D240(ab77854；1:1000)均由Abcam提供，Anti-phospho-VEGF Receptor 3(CB5793；1:200)由北京清源浩生物科技有限公司提供，Anti-phospho-AKT (SAB4504016，1:1000)由Sigma提供。

1.4 陽(yáng)性率觀(guān)察方法 顯微鏡下可見(jiàn)棕色或棕黃色陽(yáng)性表達(dá)顆粒。每個(gè)切片選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀(guān)察著色程度和著色比例。著色程度：無(wú)色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；褐色3分。著色比例：著色細(xì)胞數(shù)不足5.0%0分；5.0%～25%1分；26%50%2分；＞50%3分。陽(yáng)性得分=著色程度×著色比例，根據(jù)陽(yáng)性得分，分為四個(gè)等級(jí)，0～1分為陰性，以“-”表示；2～3分為弱陽(yáng)性，以“+”表示；4～6分為陽(yáng)性，以“++”表示；＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性，以“+++”表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得陽(yáng)性率均以百分比(%)表示，陽(yáng)性等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，陽(yáng)性率的比較采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P-VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá) A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的P-VEGFR-3陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯高于B組(P＜0.01或P＜0.05)，B組明顯高于C組(P＜0.01)，C組和D組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組患者P-VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá)情況[例（%）]

2.2 P-AKT的陽(yáng)性表達(dá) A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的P-AKT陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯高于B組(P＜0.05)，B組明顯高于C組(P＜0.05)，C組和D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組患者P-AKT的陽(yáng)性表達(dá)情況[例（%）]

2.3 P-PDGFR-α的陽(yáng)性表達(dá) A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的P-PDGFR-α陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯高于B組(P＜0.01或P＜0.05)，B組明顯高于C組(P＜0.05)，C組和D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組患者P-PDGFR-α的陽(yáng)性表達(dá)情況[例(%)]

2.4 D2-40的陽(yáng)性表達(dá) A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的D2-40陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯高于B組(P＜0.01)，B組明顯高于C組(P＜0.05)，C組和D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組患者D2-40的陽(yáng)性表達(dá)情況[例（%）]

3 討論

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，受多重因素的影響，然而淋巴管的形成為其形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，也是供養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的必要條件。已有研究[5]證實(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌致死的最主要原因之一，也是婦科臨床亟待解決的重要課題。當(dāng)前研究背景下，對(duì)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)研究主要集中于以下幾點(diǎn)：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C及其受體系統(tǒng)(VEGF-C/VEGFR-3)、表皮生長(zhǎng)因子受體系統(tǒng)(EGFR/HER-2)、趨化因子受體及配體系統(tǒng)(CXCR/CCL)、抑瘤基因及金屬基質(zhì)蛋白酶。其中P-VEGFR-3、P-PDGFR-α及P-AKT為與VEGF-C/VEGFR-3和EGFR/HER-2系統(tǒng)密切相關(guān)的效應(yīng)因子，在甲狀腺癌、乳腺癌、原發(fā)性肝癌等多種惡性腫瘤的研究中，均已被證實(shí)為異常高表達(dá)。部分研究結(jié)果顯示各因子聯(lián)合D2-40檢測(cè)對(duì)惡性腫瘤的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估具有較高價(jià)值，然而其在子宮內(nèi)膜癌中的研究尚為少見(jiàn)[6]。就淋巴細(xì)胞的遷移性而言，各類(lèi)惡性腫瘤具有高度的相似性，本次研究對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40表達(dá)情況作初步研究，以進(jìn)一步探討其臨床價(jià)值。

VEGF-C是目前為止發(fā)現(xiàn)的最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)刺激因子，其主要受體為VEGFR-2及VEGFR-3[7]。研究已證實(shí)，VEGFR-3與VEGF-C結(jié)合后，可通過(guò)多條途徑發(fā)生磷酸化，促進(jìn)淋巴管新生和腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌VEGFR-3表達(dá)水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌，且無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌表達(dá)水平顯著高于非典型性增生和炎癥性疾病，證實(shí)了VEGFR-3對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷和預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(Phosphatidylinositol3-kinase/serine/threonine kinase，PI3K/AKT)為EGFR/HER-2信號(hào)的下游通路，在多種惡性腫瘤中均有活化，主要參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程。因P-AKT是AKT的主要活性形式，PI3K/AKT通路的活化又以P-AKT的異常高表達(dá)為主要標(biāo)志。國(guó)內(nèi)學(xué)者張曉明等[9]對(duì)95例子宮內(nèi)膜癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型癌和Ⅱ型癌的P-AKT陽(yáng)性表達(dá)率均為50%左右，而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高達(dá)89.2%；本研究亦發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織P-AKT陽(yáng)性表達(dá)率分別為88.0%、56.0%，與張曉明等[9]研究結(jié)果具有高度的一致性。血小板增多癥一度被認(rèn)為是伴癌綜合征，血小板包裹腫瘤細(xì)胞一方面可使其產(chǎn)生免疫逃逸作用；另一方面還能夠分泌血小板血管通透因子，促進(jìn)病灶的胞外轉(zhuǎn)移。隨著分子靶向治療的發(fā)展，PDGF在腫瘤的研究中日益受到重視。實(shí)質(zhì)上，PDGF是最早發(fā)現(xiàn)的多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子之一，與細(xì)胞的分裂和增殖密切相關(guān)，與其特異性受體結(jié)合后才能發(fā)揮生物學(xué)活性。PDGFR-α為其特異性受體之一，在與PDGF結(jié)合后首先發(fā)生自身磷酸化，與具有SH2結(jié)構(gòu)域的底物結(jié)合，包括PI3K，因此P-PDGFR-α亦為PI3K/AKT的重要效應(yīng)因子之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)P-PDGFR-α在各組之間的表達(dá)趨勢(shì)與P-AKT基本一致，但有少許差異，主要是由于除PI3K/AKT外，P-PDGFR-α還受其他因素的影響，如多種原癌基因和細(xì)胞因子。

D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，已有研究證實(shí)宮頸癌與子宮內(nèi)膜癌的微淋巴管密度預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明淋巴管密度對(duì)子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評(píng)估具有重要作用[11]。另有部分研究[12]指出D2-40表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、臨床分期等均呈正相關(guān)，對(duì)腫瘤系疾病的臨床診斷中具有重要價(jià)值。本研究亦發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜疾病中，D2-40與P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α具有相似的表達(dá)趨勢(shì)，不僅可用于癌變的診斷，還可應(yīng)用于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估。

綜上所述，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40均為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)記物，可作為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)深入研究。

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Expression and significance of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in endometrial cancer.

LINChun-hua,TANG Mi,CHEN Min,LIU Man,SANG Na.

Department of Pathology,Hunan Maternal and Child Health Hospital,Changsha 410008,Hunan,CHINA

ObjectiveTo analyze the protein expression difference of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in the pathological tissues of endometrial cancer,atypical hyperplasia of endometrium(AHE)and endometrial inflammatory disease(EID),so as to explore their clinical detection value.MethodsThe pathological tissues of endometrial cancer with lymphatic metastasis,endometrial cancer without lymphatic metastasis,AHE and EID(each with 25 samples)were observed under the microscope after immunohistochemistry,and the positive expression of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 were detected and analyzed with Riddit,Fisher and SPSS16.0 statistical software.ResultsThe positive expression rate and degree of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in endometrial cancer with lymphatic metastasis were all higher than those in endometrial cancer without lymphatic metastasis;the positive expression rate and degree of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in endometrial cancer without lymphatic metastasis were all higher than those in AHE;and the difference had statistical significance(P＜0.05).But there was no statistically significant difference in positive expression rate and degree of P-VEGFR-3, P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 between AHE and EID(P＞0.05).ConclusionP-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 are closely related to the occurrence of endometrial cancer and lymphatic metastasis,thus could provide evaluation index for clinical diagnosis and prognosis evaluation.

P-PDGFR-α;P-VEGFR-3;P-AKT;D2-40;Endometrial cancer

R737.33

A

1003—6350（2014）24—3634—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1417

2014-08-27)

湖南省衛(wèi)生廳科研基金課題（編號(hào)：B2010—083）

林春華。E-mail：1370065571@qq.com