何 洋 ，何紹斌 ，金 文 ，林以慈 ，羅鈞錦 ，石 鉞

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 2.廣州市悠好福醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510610）

消渴脈康顆粒是由黃芪、枸杞子、桑寄生、赤芍、丹參、地黃、牛膝、延胡索等組方，由醫(yī)學(xué)名著《醫(yī)學(xué)心悟》中治療消渴病的黃芪湯化裁而來，具有健脾益腎、活血通絡(luò)之功效，用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變。經(jīng)過多年臨床應(yīng)用證實(shí)，其具有較好的臨床療效。為有效控制藥品的質(zhì)量，確保該制劑的臨床療效，本試驗(yàn)對(duì)組方中各藥材建立了定性鑒別方法，對(duì)方中主藥赤芍的有效成分芍藥苷建立了高效液相色譜(HPLC)定量測(cè)定方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所建方法簡(jiǎn)便易行、靈敏準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于消渴脈康顆粒的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

CAMAG薄層色譜掃描儀；Waters 1525型高效液相色譜儀（Waters 1525系統(tǒng)，Waters 2487檢測(cè)器，Mellennium32色譜工作站）；TU-1800型紫外分光光度計(jì)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（220 V，250 W，40 kHz）；Mettler AB135-S 型十萬(wàn)分之一電子天平。枸杞子對(duì)照藥材（批號(hào)為121072-201109）、齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)為 110709-201206）、原兒茶醛對(duì)照品（批號(hào)為110810-201007）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為 100081-200907）、延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)為110726-201213）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-200613）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201337），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。消渴脈康顆粒（廣州市悠好福醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為 20130404，20130405，20130406）。薄層層析用硅膠G和硅膠 GF254，購(gòu)自青島海洋化工廠。甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜(TLC)定性鑒別

2.1.1 牛膝

取本品 10 g，研細(xì)，加甲醇 - 水（8 ∶2）100 mL，硫酸 1 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，用石油醚（60～90℃）提取2次，每次20 mL，提取液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取齊墩果酸對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺牛膝的消渴脈康顆粒同法制備陰性對(duì)照品溶液。照 2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄Ⅵ B中TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各 20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以氯仿 -甲醇（40∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(見圖1 A)。

2.1.2 丹參

取2.1.1項(xiàng)下石油醚提取后的水溶液，用乙醚提取2次，每次20 mL，提取液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取原兒茶醛對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺丹參的消渴脈康顆粒同法制備成陰性對(duì)照品溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB中TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 GF254薄層板上，以氯仿 - 丙酮 - 甲酸（7.9 ∶1.1 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(見圖1 B)。

2.1.3 枸杞子

取2.1.2項(xiàng)下乙醚提取后的水溶液，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，提取液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺枸杞子的消渴脈康顆粒同法制成陰性對(duì)照品溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB中TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯 -氯仿-甲酸（2.5 ∶2 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(見圖1 C)。

2.1.4 桑寄生

取本品 20 g，研細(xì)，加甲醇 - 水（8 ∶2）100 mL，硫酸 1 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，用石油醚（60～90℃）提取2次，每次20 mL，棄去，水溶液繼續(xù)乙醚提取，提取2次，每次30 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，加到聚酰胺1 g中，拌勻，干燥后，加至聚酰胺柱（2 g），先用30 mL水洗脫，棄去，繼續(xù)用30 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺桑寄生的消渴脈康顆粒同法制成陰性對(duì)照品溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB中TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一用2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯（水飽和）-甲酸乙酯 -甲酸（5∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5%三氯化鋁乙醇溶液顯色，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(見圖1 D)。

2.1.5 延胡索

取本品20 g，研細(xì)，加水100 mL，加熱回流4 h，濾過，濾液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑2.0 cm，長(zhǎng)10 cm），以水100 mL洗脫，棄去水液。再用10%乙醇50 mL洗脫，棄去10%乙醇洗脫液，續(xù)用95%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液70 mL，濃縮至10 mL，作為供試品溶液。另取延胡索乙素對(duì)照品，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺延胡索的消渴脈康顆粒同法制成陰性對(duì)照品溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB中TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏數(shù)秒鐘后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(見圖1 E)。

2.1.6 黃芪

吸取 2.1.5項(xiàng)下供試品溶液 5 mL，蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，加到硅膠1 g中，拌勻，干燥后，加至2 g硅膠柱，用30 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺黃芪的消渴脈康顆粒同法制備成陰性對(duì)照品溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄Ⅵ B中 TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈（365 nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(見圖1 F)。

2.2 芍藥苷HPLC法定量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫公司 Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（29 ∶71）；流速：1.0 mL /min；柱溫：30 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

圖1 薄層色譜圖

2.2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.117 2 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取消渴脈康顆粒（批號(hào)為20130404）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。根據(jù)消渴脈康顆粒處方，取除赤芍外的其他處方量藥材，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備方法制成陰性對(duì)照品。按供試品溶液制備方法操作，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取 2.2項(xiàng)下 3種溶液各 10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)大于3 000；供試品溶液色譜中芍藥苷與相鄰峰為基線分離，分離度大于1.5；陰性對(duì)照品溶液色譜中無芍藥苷的色譜峰，說明測(cè)定無干擾。見圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品溶液 3.0，5.0，7.0，10.0，13.0，15.0 μL 注入高效液相色譜儀中，按擬訂色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝130 584 X-137 510（r＝ 0.999 5）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在 0.266 4 ～ 1.332 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定5次。結(jié)果的 RSD為0.98%(n＝5)，表明儀器精密度較高，可靠性強(qiáng)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，6，8 h 時(shí)各測(cè)定 1 次。結(jié)果的 RSD 為 0.28%(n＝5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為20130404）5份，按擬訂色譜條件測(cè)定芍藥苷的含量。結(jié)果的 RSD為2.37%(n＝5)，表明方法重現(xiàn)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取批號(hào)為20130404的樣品（芍藥苷含量0.325 3%）研細(xì)，取約 0.5 g，精密稱取 6份，分別加入對(duì)照品溶液10 mL，按供試品溶液的制備方法操作，精密吸取供試品溶液10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

圖2 高效液相色譜圖

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，測(cè)定3批次樣品中芍藥苷的含量。結(jié)果批號(hào)為20130404，20130405，20130406的 3批次樣品中芍藥苷的平均含量分別為 32.53，33.19，32.94 mg /g。

3 討論

本品具有健脾益腎、活血通絡(luò)之功效，用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變。赤芍為方中要藥，具有活血通經(jīng)之功效，有效成分芍藥苷具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。故選擇芍藥苷作為本品的含量測(cè)定指標(biāo)，與本品的功能具有較高的相關(guān)性。

用50%乙醇為提取溶劑，對(duì)回流法和超聲法處理樣品進(jìn)行比較，結(jié)果表明，超聲法提取效率較高，故選用超聲法提取芍藥苷。用 50% 乙醇為提取溶劑，分別采用超聲 10，20，30，40，60 min進(jìn)行提取。結(jié)果表明，超聲40 min可以提取完全，故選擇40 min為樣品提取時(shí)間。

流動(dòng)相選擇中，分別考察了乙腈-0.1%磷酸溶液[1]、甲醇-水等系統(tǒng)[2-4]的不同配比。結(jié)果表明，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（29∶71）為流動(dòng)相最為理想，此條件下芍藥苷與其他成分能夠較好地分離，陰性無干擾，且樣品處理方法簡(jiǎn)單，可作為本品質(zhì)量控制的理想方法。

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