鄧麗麗 ，臧家娜 ，余陳歡 ，俞 冰

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013）

計算機輔助藥物設(shè)計（CADD）應(yīng)用量子力學(xué)、分子動力學(xué)、構(gòu)效關(guān)系等基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，研究藥物對酶、受體等作用的藥效模型，從而達(dá)到藥物設(shè)計的目的，是實現(xiàn)合理藥物設(shè)計的基本手段和工具。目前，該技術(shù)已滲透并介入到藥物發(fā)現(xiàn)、設(shè)計、開發(fā)等各個階段，通過對藥物先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化及新的作用蛋白靶點的模型構(gòu)建，簡化了藥物研究的前期過程，從而比以往的高通量篩選技術(shù)，顯現(xiàn)出了獨特的優(yōu)越性[1]。隨著近年來生物信息學(xué)技術(shù)和化學(xué)信息技術(shù)的不斷革新，新的作用蛋白靶點不斷被研究、發(fā)現(xiàn)和構(gòu)效解析，為CADD的研究提供了廣闊的發(fā)展空間，同時也為中藥及其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了強大的工具，為中藥及其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制的研究帶來新的機遇。石薺Mosla scabra為唇形科草本植物，具有清熱解毒、理氣化濕的功效，《浙江民間常用草藥》記載其主治夏日感冒、腹痛泄瀉、跌打損傷等[2]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，石薺 （MDE）具抗炎、抗流感病毒作用[3-4]。本試驗中，在MDE藥效機制及化學(xué)成分分析[5-6]的基礎(chǔ)上，采用分子力學(xué)和柔性分子對接相結(jié)合的方法，以5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮及其衍生物為候選藥物，研究其與流感血凝素蛋白（HA）、流感神經(jīng)氨酸酶（NA）、炎癥靶點環(huán)氧合酶 2（COX-2）和炎癥靶點磷酸二酯酶 4（PDE4）受體的相互作用，在此基礎(chǔ)上闡明MDE抗流感病毒的作用機制，為從植物天然產(chǎn)物中篩選流感藥物先導(dǎo)化合物指明方向，也為有針對性地修飾現(xiàn)有的流感藥物提供理論依據(jù)。

1 試驗工具與方法

1.1 試驗工具

本研究的蛋白靶點均從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中獲取。5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮及其衍生物均由 Chem Bio 3D Ultra 12.0（美國劍橋公司）構(gòu)建。采用 Sybyl-X1.1軟件（美國Tripos公司）中的 Surflex-dock模塊和 DS 2.5軟件（美國 Accelrys公司）中的 Pharmacophore Generation模塊進(jìn)行。采用 iGEMDOCK軟件（臺灣國立Chiao Tung大學(xué)）進(jìn)行分子力學(xué)分析。所有計算均在Windows XP操作系統(tǒng)上完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 石薺 黃酮類成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

結(jié)合中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫的子數(shù)據(jù)庫“中藥與有效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”以及PubMed數(shù)據(jù)庫的子數(shù)據(jù)庫“Pub Chem compound”，通過 Chem Bio 3D Ultra 12.0 軟件，將其在MMFF94力場下進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并保存為SDF格式。候選藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 候選藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2.2 針對各靶點的分子對接

HA：HA的晶體結(jié)構(gòu)引自 PDB數(shù)據(jù)庫，分辨率為 2.50?（PDB ID：2HTY）。保留晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)活性腔附近Ca2+和2個結(jié)合水分子，刪除其他雜原子，然后用Biopolymer模塊修正蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵、添加氫原子（pH＝7）和末端氨基酸殘基的修飾。因為抑制劑和血凝素蛋白的作用是發(fā)生在水溶液中，故采用半徑為8?的TIP3P水模型，將血凝素蛋白結(jié)構(gòu)置于其中。

NA：NA的晶體結(jié)構(gòu)引自PDB數(shù)據(jù)庫，分辨率為2.49?（PDB ID：309K）。保留結(jié)晶水，對照 NA-乙酰葡萄酰胺（NAG）復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1F8B)補齊缺失殘基，并加入氫原子及其他遺漏原子，能量優(yōu)化后構(gòu)型作為對接起始結(jié)構(gòu)。將蛋白進(jìn)行預(yù)處理，刪除水分子，去掉除NAG以外的所有配體殘基；以NAG為中心生成格點，并在受體8?范圍內(nèi)進(jìn)行對接。

COX-2：COX-2的晶體結(jié)構(gòu)引自 PDB數(shù)據(jù)庫，分辨率為2.90 ?（PDB ID：4COX）。因 COX-2 為同源二聚體，在參考其活性口袋[7]的基礎(chǔ)上，選取其A鏈(即二聚體中的第1個單位)，去除配體，加氫，作為分子對接的“受體”。計算過程中僅考慮配體分子8?范圍內(nèi)的氨基酸殘基與配體的相互作用。首先固定受體COX-2的幾何構(gòu)型，優(yōu)化配體分子，然后對配體分子8?范圍內(nèi)的氨基酸不作任何限制，將配體和受體進(jìn)行分子對接。

PDE4：PDE4的晶體結(jié)構(gòu)引自PDB數(shù)據(jù)庫，為PDE-4B2B與抑制劑 NPV 的復(fù)合物，分辨率為 1.95?（PDB ID：2QYL）。將蛋白進(jìn)行預(yù)處理，刪除水分子，去掉除NPV以外的所有配體殘基；以NPV為中心生成格點，并在受體8?范圍內(nèi)進(jìn)行對接。

1.2.3 分子對接結(jié)果分析

通過iGEMDOCK模塊測得MDE黃酮類化合物與各蛋白受體關(guān)鍵氨基酸殘基間的范德華作用能、靜電作用能、氫鍵能等數(shù)據(jù)，以軟件綜合評分（匹配度）為指標(biāo)進(jìn)行對接效果評價。其他設(shè)置均采用默認(rèn)值。采用DS 2.5軟件對候選藥物與作用蛋白受體活性位點進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 以HA為靶點的分子對接結(jié)果

采用iGEMDOCK軟件對候選藥物與HA活性位點進(jìn)行分子對接，結(jié)果按打分高低排序，經(jīng)統(tǒng)計分析，匹配度打分小于-5（門檻值）的候選藥物共有6個（表1），打分高低排序靠前的5個化學(xué)成分分子分別為木犀草素＞槲皮素＞黃芩素＞漢黃芩素＞花椒油素，其中以木犀草素與HA活性位點的匹配度最高，證明MDE中所含的黃酮類化合物為天然HA抑制劑。這與Liu等[8]報道的結(jié)果一致。同時，由表1可知，各藥物作用能和總能量等數(shù)據(jù)基本相似，以木犀草素為例，其范德華作用能為-43.26 kcal/mol，氫鍵能為 -26.98 kcal/mol，表明木犀草素等優(yōu)勢候選藥物與血凝素蛋白之間的主要作用是范德華力。

2.2 以NA為靶點的分子對接結(jié)果

采用iGEMDOCK軟件對候選藥物與NA活性位點進(jìn)行分子對接，結(jié)果按打分高低排序，經(jīng)統(tǒng)計分析，各候選藥物的匹配度分值均小于-5（表1）。打分高低排序靠前的5個化學(xué)成分分子分別為鼠李檸檬素＞槲皮素＞黃芩素＞桑色素＞MF2，其中以鼠李檸檬素與NA活性位點的匹配度最高，證明MDE中所含的黃酮類化合物為天然NA抑制劑。這與王海娣等[9]報道的結(jié)果一致。同時，由表1可知，各藥物作用能和總能量等數(shù)據(jù)基本相似，以鼠李檸檬素為例，其范德華作用能為-64.18 kcal/mol，氫鍵能為-30.79 kcal/mol，表明鼠李檸檬素等優(yōu)勢候選藥物與 NA之間的主要作用是范德華力。

2.3 以COX-2為靶點的分子對接結(jié)果

采用iGEMDOCK軟件對候選藥物與COX-2活性位點進(jìn)行分子對接，結(jié)果按打分高低排序，經(jīng)統(tǒng)計分析，各候選藥物的匹配度打分均遠(yuǎn)小于-5（表2）。打分高低排序靠前的5個化學(xué)成分分子分別為槲皮素＞MF2＞木犀草素＞桑色素＞金合歡素，其中以槲皮素與COX-2活性位點的匹配度最高，證明MDE中所含的黃酮類化合物均為天然COX-2抑制劑。同時，由表2可知，各藥物作用能和總能量等數(shù)據(jù)基本相似，以槲皮素為例，其范德華作用能為 -53.25 kcal/mol，氫鍵能為 -25.10 kcal/mol，表明槲皮素等候選藥物與COX-2之間的主要作用是范德華力。

2.4 以PDE4為靶點的分子對接結(jié)果

采用iGEMDOCK軟件對候選藥物與PDE4活性位點進(jìn)行分子對接，結(jié)果按打分高低排序。由于PDE4的活性口袋并非封閉性結(jié)合腔，對接分子與結(jié)合腔殘基的碰撞情況較少，故整體的對接打分區(qū)分度不大，但對接結(jié)果較好的分子仍應(yīng)視為可能具有PDE4抑制活性的化合物。經(jīng)統(tǒng)計分析，各候選藥物的匹配度打分均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 -5（表2）。打分高低排序靠前的5個化學(xué)成分分子分別為鼠李檸檬素＞黃芩素＞槲皮素＞山柰酚＞金合歡素，其中以鼠李檸檬素與PDE4活性位點的匹配度最高，證明MDE中所含的黃酮類化合物均為天然PDE4抑制劑。同時，由表2可知，各藥物作用能和總能量等數(shù)據(jù)基本相似，以鼠李檸檬素為例，其范德華作用能為 -90.29 kcal/mol，靜電作用能為 -17.96 kcal/mol，氫鍵能為 -11.98 kcal/mol，表明鼠李檸檬素等優(yōu)勢候選藥物與PDE4之間的主要作用是范德華力。

2.5 石薺 黃酮類成分抗流感作用的綜合評價

以HA，NA，COX-2和PDE4分子對接打分排序前20%的分子作為可能具有 HA，NA，COX-2和 PDE4生物抑制活性的分子，分析MDE中MF1及其衍生物的多靶導(dǎo)向作用。由表1及表2可知，共有7個化合物（黃芩素、鼠李檸檬素、槲皮素、木犀草素、金合歡素、桑色素和MF2）可同時抑制2個及以上靶標(biāo)蛋白，其中槲皮素對4個靶標(biāo)均呈較強的抑制作用，提示這些化合物可作為潛在的抗病毒、抗炎先導(dǎo)化合物。而MF1，MF2和MF3也均表現(xiàn)出不同程度的抗流感病毒和抗炎作用，證明這三者是MDE發(fā)揮抗流感病毒和抗炎作用的藥效物質(zhì)。

3 討論

CADD是近年來發(fā)展起來的研究與開發(fā)新藥的一種嶄新技術(shù)，以量子化學(xué)、分子力學(xué)和分子動力學(xué)等為理論依據(jù)，借助計算機數(shù)值計算和邏輯判斷、數(shù)據(jù)庫、圖形學(xué)、人工智能等處理技術(shù)，進(jìn)行合理的藥物設(shè)計。CADD的出現(xiàn)大大加快了研制新藥的速度，節(jié)省了新藥開發(fā)工作的人力、物力和財力，因為它從理論的角度出發(fā)，可避免以前研究中一定程度的盲目性，能進(jìn)行直觀地設(shè)計，指導(dǎo)有目的地開發(fā)新藥[10]。以美國 Structure Bioinformatics Inc.(SBI)提供的數(shù)據(jù)為例，平均每個新靶點需篩選10萬個化合物，其命中率為0.1% ～0.01%，而以CADD進(jìn)行新藥設(shè)計，其命中率可提高到 5%～20%，可減少 99.9%的費用。目前應(yīng)用CADD成功設(shè)計出的新型藥物已有大量報道，如由Merck Sharp and Dohme公司開發(fā)的用于治療青光眼的碳酸酐酶抑制劑多佐拉米（Dorzolamid）、由Roche公司開發(fā)的 HIV蛋白酶抑制劑類抗艾滋病藥物沙奎那韋（saquinavir）等，而設(shè)計成功已進(jìn)入臨床研究階段的藥物更多。世界上許多規(guī)模較大的制藥公司，近20年來紛紛投入巨資建立計算機理論和應(yīng)用研究部門，以帶動新藥開發(fā)。

表1 候選藥物與HA及NA的分子對接結(jié)果

表2 候選藥物與COX-2及PDE4的分子對接結(jié)果

中草藥治療流行性感冒有數(shù)千年的歷史，不少方藥具有獨特的療效，并通過多靶點、多途徑發(fā)揮作用[11-12]。這種多靶向作用一方面表現(xiàn)在多成分的多靶向作用，另一方面也可能存在單個分子的多靶向作用，而正是由于這種多靶向“霹彈”作用的原理，彌補了中藥復(fù)方針對單靶藥效不強的缺陷，表現(xiàn)出整體治療、治調(diào)并舉的特色。如何用現(xiàn)代語言闡釋這種整體治療的原理與特色，到目前為止還是中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的難點之一。中草藥在防治流感病毒方面具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景[13]，但中藥及其復(fù)方常含有數(shù)百種化學(xué)成分，其真正的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)目前還知之甚少，其防治疾病的分子機制也尚未明確。因此，有必要對中藥及其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制進(jìn)行深入研究，并作出科學(xué)詮釋。

本試驗中通過CADD技術(shù)，綜合應(yīng)用分子對接、藥效團(tuán)模型及虛擬篩選方法，以抗流感病毒和抗炎作用為研究對象，對多靶點治療的藥效學(xué)作出闡釋。選取目前已明確的流感病毒蛋白靶標(biāo)（HA和 NA）及炎癥靶標(biāo)（COX-2和 PDE4），對化學(xué)成分分子庫進(jìn)行虛擬篩選，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合分析。由表1及表2可知，MDE中化學(xué)成分對流感病毒蛋白靶點和炎癥相關(guān)蛋白靶點均具有一定的結(jié)合和抑制效應(yīng)。MDE不僅存在多成分多靶點效應(yīng)，而其中一些單分子本身也具有多靶點導(dǎo)向作用，即1個分子能同時對2個或2個以上的靶點產(chǎn)生作用，證明了中藥及其復(fù)方多靶點治療效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

由于流感及其續(xù)發(fā)病癥發(fā)病機理涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶點繁復(fù)龐雜，相關(guān)機制也正在深入研究之中。作為一項探索性研究，本試驗只選擇了與流感及其續(xù)發(fā)病癥病毒性肺炎明確相關(guān)的炎癥機制中的幾個關(guān)鍵靶點進(jìn)行研究，靶標(biāo)選擇數(shù)量上略顯不足。在后續(xù)工作中，靶標(biāo)數(shù)目的增加，無疑將增強MDE多靶點導(dǎo)向效應(yīng)的說服力度。

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