汪 紅，徐 政，于正洋，李 浩，夏 凡，陳鐸元，徐 恒

（四川大學 生命科學學院，四川 成都 610064）

1 創(chuàng)新性實驗思路

教學實踐是培養(yǎng)學生動手能力和創(chuàng)新能力的重要途徑，而教學內容的更新是培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的關鍵。微生物基礎實驗課的內容大多屬于陳舊性實驗，實驗技術方法龐雜，細節(jié)眾多，學生容易感到枯燥而厭學。為了改變現(xiàn)狀，增加創(chuàng)新性實驗內容，提高學生對微生物實驗的興趣，我們開設“蛭弧菌對污水生物凈化效果的實驗觀察”實驗。該實驗內容新穎，并與生產實際相結合，特別是低年級學生對貼近生活的實驗非常感興趣，調動了學生的主觀能動性，有利于培養(yǎng)學生在微生物實驗中的動手能力和創(chuàng)新能力，也能讓大學生理解微生物與環(huán)境工程的交叉，提高學習微生物知識的積極性。

噬菌蛭弧菌比細菌小，能通過細菌濾器，有類似噬菌體的作用，但它不是病毒，確確實實是一類能“吃掉”細菌的細菌，是一類寄生于其他細菌并能導致其裂解的革蘭氏陰性細菌［1－2］。該菌能夠在較短時間內清除水中的沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、弧菌屬等菌屬，可消除致病菌，控制或減少致病菌對環(huán)境水源的污染［3］。由于蛭弧菌能裂解多種細菌，并且生活方式特殊，具有生態(tài)優(yōu)勢，因此被認為是自然凈化的生物因子之一，在微生態(tài)研究領域已被作為一種新型微生態(tài)制劑的菌種得到開發(fā)和應用［4－7］。生活污水中常含有大腸桿菌，其含量常作為水質污染度的鑒定標準之一。蛭弧菌是能快速清除水體中有害菌，改善和穩(wěn)定養(yǎng)殖環(huán)境，維護水產動物健康生長的無污染、無殘留的“綠色”制劑［8－13］。因此，利用其這一特性對水產養(yǎng)殖中水體的生物凈化和水產品污染病原菌的防控具有廣泛的發(fā)展前景。

開設“蛭弧菌對污水生物凈化效果的實驗觀察”實驗，學生對微生物中的小細菌（蛭弧菌）有了感性認識，并通過平板菌落計數(shù)法和雙層平板法的實驗內容，提升學生的實驗技能。由于實驗內容新穎、貼近生活和生產實際相結合，很能激發(fā)學生的實驗興趣和創(chuàng)新熱情。因此，該實驗可作為微生物基礎實驗開設創(chuàng)新性實驗內容，為創(chuàng)新人才提供良好的發(fā)展平臺。

2 材料與方法

2.1 儀器及器材

（1）儀器：顯微鏡BA210型，生化培養(yǎng)箱LRH－250A型，電子天平BS224S型，高壓滅菌鍋LDZX－30KBS型，電熱干燥箱DHG－9240型，超凈工作臺SW－CJ－1F型，冰箱BCD－301型，高速離心機LR56495型，普通離心機LD4－2型。

（2）器材：玻璃試管；培養(yǎng)皿；移液槍（5mL，1 000 μL，50μL，10μL）；酒精燈；三角瓶；細菌過濾器。

（3）菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）；蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovoru）（蛭弧菌由徐恒教授課題組提供）。

（4）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉粉5g（質量分數(shù)為0.5%）；蛋白胨10g（質量分數(shù)為1%）；瓊脂20g（質量分數(shù)為2%）；蒸餾水1 000mL；pH 7.0～7.2。

（5）雙層平板培養(yǎng)基：下層瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂17.5g（質量分數(shù)為1.75%）；蒸餾水1 000mL。

上層LB培養(yǎng)基：蛋白胨5g（質量分數(shù)為0.5%）；酵母提取物1.5g（質量分數(shù)為0.15%）；NaCl 2.5g（質量分數(shù)為0.25%）；瓊脂4g（質量分數(shù)為0.4%）；蒸餾水1 000mL。

（6）平板技術培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g（2.3.0.5%）；葡萄糖1g（2.3.0.1%）；酵母提取物5g（2.3.0.5%）；瓊脂15g（2.3.1.5%）；蒸餾水1 000mL；pH6.8～7.0。

（7）無菌生理鹽水NaCl（質量分數(shù)為0.85%）。

2.2 大腸桿菌懸液的制備

將大腸桿菌接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，在37℃培養(yǎng)24h后，吸取1.0mL無菌水在大腸桿菌的斜面上，用接種環(huán)鉤分散乳化菌苔，制備菌懸液備用。

2.3 蛭弧菌純液的制備

挑取蛭弧菌單斑浸泡于1.5mL無菌水中，搗碎混勻，10 000 g離心10min，得到蛭弧菌懸液；在3.5 mL上層LB培養(yǎng)基（50℃）中加入0.3mL蛭弧菌液和0.2mL大腸桿菌菌懸液，混勻后立即傾注于預制底層培養(yǎng)基上，待凝固后置于32℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24～120h，觀察噬菌斑出現(xiàn)及大?。淮该魇删弋a生后，挑取單斑浸泡于無菌水中，高速旋渦，將浸泡液進行梯度稀釋，取合適梯度再做雙層平板培養(yǎng)，連續(xù)傳代3～5次，直到有明顯的圓形噬菌斑出現(xiàn)；從平板上挑取單斑浸泡于5mL無菌水中，搗碎混勻，10 000 g離心10min，取含有蛭弧菌和大腸桿菌的上清液，利用細菌過濾器除去大腸桿菌，獲得純的蛭弧菌液。

2.4 滅活蛭弧菌純液的制備

取1mL純的蛭弧菌于無菌試管中，用木架子夾住試管，在酒精燈上加熱沸騰5min，讓蛭弧菌失去活性。

2.5 污水采集

用無菌瓶采集魚塘污水250mL，常溫保存運輸至實驗室。

2.6 實驗方法

2.6.1 污水凈化培養(yǎng)與指標檢測

將實驗污水搖勻，按2.6.2節(jié)中的方法進行細菌總數(shù)計數(shù)；取2個50mL無菌錐形瓶，分別加入30 mL污水，其中一個錐形瓶中加0.5mL蛭弧菌純液，編號為1號；另一個錐形瓶中加0.5mL被滅活蛭弧菌純液，編號為0號；將2個三角瓶放在35℃培養(yǎng)箱，1、3、5、7d分別取樣檢測污水培養(yǎng)液中的細菌總數(shù)和蛭弧菌生長菌斑。

2.6.2 平板計數(shù)法測定細菌總數(shù)

分別從培養(yǎng)的0號、1號水樣中取出1mL培養(yǎng)液于無菌試管中，用生理鹽水將培養(yǎng)液濃度稀釋成10－1，同樣的方法稀釋水樣為10－2、10－3，根據(jù)情況確定是否稀釋至10－4；將稀釋后的水樣混合均勻，從中取出1mL，加入培養(yǎng)皿中；將溶解并冷卻至50℃左右的平板計數(shù)培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿中，每皿約20mL；左右交換搖勻，待凝固后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d，觀察并計數(shù)每皿菌落數(shù)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)計算樣液中細菌總數(shù)。

2.6.3 雙層平板法檢測蛭弧菌

將融化的下層瓊脂培養(yǎng)基倒入20mL于無菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固，在3.5mL上層LB培養(yǎng)基（50℃）中加入0.3mL污水樣1號和0.2mL大腸桿菌菌懸液，混勻后立即傾注于預制底層培養(yǎng)基上，待凝固后置于32℃培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24～120h，觀察噬菌斑。

3 結果與分析

3.1 污水中細菌的生長觀察

在相同培養(yǎng)條件下，于1、3、5、7d分別取0號和1號培養(yǎng)液，稀釋至10－2進行平板計數(shù)觀察。結果表明，加蛭弧菌的污水培養(yǎng)物，隨著培養(yǎng)時間的延長，計數(shù)平板上菌落數(shù)持續(xù)減少，而加滅活蛭弧菌的污水培養(yǎng)物，則菌落數(shù)變化不大（詳見圖1和圖2）。

圖1 1號樣中細菌的生長情況

圖2 0號樣中細菌的生長情況

3.2 污水中細菌總數(shù)結果分析

通過對實驗污水原液和加蛭弧菌（1號）與滅活蛭弧菌對照污水（0號）連續(xù)培養(yǎng)，并于1、3、5、7d取樣進行細菌總數(shù)測定。結果表明，有蛭弧菌作用的污水中的細菌數(shù)3d后比滅活蛭弧菌的污水低，說明蛭弧菌對污水中特定細菌群具有侵染與裂解作用，詳見圖3。

圖3 污水培養(yǎng)液中細菌數(shù)的變化

3.3 雙層平板實驗結果分析

將蛭弧菌與污水混合培養(yǎng)后，分別于1、3、5d取樣進行雙層平板實驗，檢測蛭弧菌生長情況。結果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，蛭弧菌菌斑數(shù)量逐漸增加，詳見圖4。

圖4 1號樣中蛭弧菌斑的生長情況

4 討論

本實驗成功建立了蛭弧菌對污水凈化實驗及其細菌和蛭弧菌指標檢測，利用蛭弧菌對特定細菌的浸染與裂解作用，并通過平板計數(shù)法和雙層平板法觀察到蛭弧菌對污水中細菌的裂解現(xiàn)象，說明蛭弧菌對革蘭氏陰性細菌有裂解作用，而不是對所有細菌均有作用。加有蛭弧菌的污水，其細菌數(shù)低于對照很多，同時噬菌斑隨時間延長逐漸增多。

通過開設“蛭弧菌對污水生物凈化效果的實驗觀察”實驗，學生對微生物中的小細菌（蛭弧菌）有了更深的認識，并對蛭弧菌能顯著改善魚塘中的微生物環(huán)境，減少養(yǎng)殖水產生物的致病率，提高養(yǎng)殖經濟效益，產生濃厚的興趣，這樣有助于學生動手能力和科學素質的培養(yǎng)。由于實驗內容新穎，貼近生活，具有創(chuàng)新性，為開設創(chuàng)新性教學實驗奠定了基礎。

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