李又空，周家杰，張先覺，鐘雯，郭華雄

(荊州市中心醫(yī)院泌尿外科1、內分泌科2、病理科3，湖北荊州434200)

E-cadherin在積水腎組織中的表達及意義

李又空1，周家杰1，張先覺1，鐘雯2，郭華雄3

(荊州市中心醫(yī)院泌尿外科1、內分泌科2、病理科3，湖北荊州434200)

目的研究不同程度積水腎組織中E-cadherin mRNA基因及蛋白表達。方法50例患者，年齡18～75歲，通過腎臟彩超將其分為輕度、中度、重度腎積水，每組分別為15例、18例、17例，同時選取健康體檢正常人群50例作為對照組；腎臟穿刺取腎皮質組織，Realtime RT-PCR及Western blot分別檢測各組E-cadherin mRNA基因及蛋白表達；分析E-cadherin表達與腎積水程度之間的關系。結果正常對照組腎臟表達非常豐富的E-cadherin mRNA基因及蛋白，而積水腎組織中E-cadherin mRNA基因及蛋白表達均顯著下降；同時隨著積水程度的不斷加重，E-cadherin表達水平進行性下降，并與腎積水程度之間存在明顯負相關關系。結論腎積水將通過不同機制下調E-cadherin表達，并進而通過EMT等中間環(huán)節(jié)導致腎小管間質纖維化，E-cadherin在其中起著非常重要的作用。

E-鈣黏連蛋白；腎積水；腎小管間質纖維化

梗阻所致腎積水是泌尿外科常見多發(fā)病，隨著積水程度的不斷加重將出現(xiàn)腎小管間質纖維化，并將直接影響腎功能[1]。目前大量研究均希望能夠通過深入研究其發(fā)生發(fā)展的分子機制，達到減輕甚至逆轉腎小管間質纖維化這一病理過程。E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)是研究熱點之一。本研究擬通過檢測不同程度積水腎組織中E-cadherin mRNA基因及蛋白的表達，探討其在腎積水纖維化中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料50例患者來源于2013年1～5月于我院泌尿外科住院治療腎積水患者，均經彩超及CT平掃明確腎積水診斷。其中男性28例，女性22例，年齡18～75歲。所有患者均于彩超定位下通過腎臟穿刺活檢取腎皮質組織。部分組織浸泡于10%多聚甲醛溶液中固定，24 h后常規(guī)包埋、切片；另一半組織迅速置入液氮中，再轉入-80℃保存。通過腎臟彩超將其分為輕度、中度、重度腎積水，每組分別為15例、18例、17例，同時選取健康體檢正常人群50例作為對照組。

1.2 超聲分級根據(jù)超聲結果對所有患者腎積水進行分級[2，3]。輕度腎積水：腎外形和腎實質無改變，僅見腎竇部出現(xiàn)窄帶狀或扁卵圓形無回聲區(qū)，腎盂輪廓飽滿，腎小盞輕度擴張，腎錐體頂端變形，腎盂分離15～25 mm；中度腎積水：腎竇區(qū)顯示“手套狀”或“煙斗狀”無回聲區(qū)，腎小盞的終末端和腎錐體頂端輪廓變平坦，腎外形和腎內其余結構物明顯改變，腎盂分離25～35 mm；重度腎積水：腎體積明顯增大，腎皮質變薄甚至完全萎縮，腎盂腎盞變形，腎竇區(qū)囊性擴張，腎盂分離大于35 mm以上。腎實質不同程度萎縮為重度腎積水的特征。根據(jù)上述標準將所有患者分為輕度、中度、重度腎積水三組，分別為15例、18例、17例。

1.3 主要試劑兔抗人E-cadherin多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；Trizol試劑及LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；RT試劑盒購自Fermentas公司；SYBR Green 1實時熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo公司；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗，BCA蛋白濃度測定試劑盒、電化學發(fā)光物試劑盒、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物公司。

1.4 免疫組化檢測E-cadherin表達石蠟切片常規(guī)脫蠟后，微波修復15 min，然后依次滴加過氧化物酶封閉液、正常山羊血清封閉液(37℃孵育20 min)、兔抗人多克隆抗體(1:100，37℃孵育30 min，之后4℃濕盒過夜)、生物素標記的二抗(37℃孵育20 min)、SABC(37℃孵育20 min)，最后滴加DAB顯色5 min，蘇木素復染后脫水封片。

1.5 Western blot檢測E-cadherin蛋白表達提取各標本總蛋白并定量，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質后轉膜，37℃封閉1 h，一抗(1:1000)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育2 h，洗膜后ECL顯影，暗室壓片曝光。所有實驗均重復3～5次。所得到蛋白條帶經掃描后計算各條帶與內參Actin吸光值(A值)的比值，此代表各標本中Nodal蛋白表達含量。所有實驗均重復3～5次。

1.6 Realtime RT-PCR檢測E-cadherin mRNA基因表達按照試劑盒說明書提取組織總RNA，并將其逆轉錄成第一鏈cDNA。E-cadherin引物序列為：正義5'-TGAGAACGAGGCTAACG-3，反義5'-GCTGTGGAGGTGGTGAG-3'；Actin引物序列為：正義5'-GGCACCACACCTTCTACA-3'，反義5'-AGTGGA AGAGTG-3'。PCR反應在Bio-Rad iQ5 Real-Time PCR Detection System上進行，通過測定PCR擴增過程中與雙鏈DNA非特異性結合的SYBR GREEN 1染料熒光強度來反映PCR產物的表達量?？偟姆磻w系為10 μl，上下游引物濃度均為10 μmol/L，具體反應條件如下：95°C預變性5 min，然后95°C變性20 s，62°C退火30 s，72°C延伸30 s，共40個循環(huán)，最后總延伸時間為5 min。以混合樣本作為模板稀釋成不同濃度梯度進行PCR反應后所得結果繪制標準曲線，計算各基因的擴增效率，GAPDH為內參基因，各目的基因表達含量通過均數(shù)±標準差(±S)來表示，通過2-ΔΔCt法解析各目的基因mRNA的表達并進行相應比較[4]。所有實驗均重復3～5次。

2 結果

2.1 免疫組化檢測積水腎組織中E-cadherin蛋白的表達免疫組化結果顯示，正常腎組織中E-cadherin表達非常豐富，其表達集中于小管上皮細胞的細胞膜及細胞相互接觸的間隙中，說明其在細胞間連接中發(fā)揮著非常重要的作用。而隨著腎積水的不斷發(fā)展，其表達不斷下降，陽性染色細胞數(shù)目不斷減少，結果見圖1。

圖1 免疫組化檢測E-cadherin蛋白表達(×200)

2.2 積水腎組織中E-cadherin蛋白及mRNA基因的表達Western blot檢測不同級別積水腎組織中E-cadherin蛋白的表達，結果提示正常對照組腎臟表達非常豐富的E-cadherin蛋白，而隨著積水程度的不斷加重E-cadherin表達不斷下降(P＜0.01)，見圖2。Realtime RT-PCR結果提示，正常對照組腎組織中E-cadherin mRNA表達豐富，隨著積水程度的不斷加重其mRNA基因表達不斷下降(P＜0.01)，其下降趨勢與蛋白表達的下降趨勢一致，見圖3。

圖2 Western blot檢測E-cadherin蛋白表達

圖3 Realtime RT-PCR檢測E-cadherin mRNA基因表達

2.3 E-cadherin表達與積水分級相關性分析相關性分析結果提示，E-cadherin蛋白表達與積水程度之間存在負相關關系(r=-0.612 5，P＜0.01)，其mRNA基因表達水平與積水程度之間同樣存在負相關關系(r=-0.622 0，P＜0.01)，因此E-cadherin表達與腎積水嚴重程度呈明顯負相關。

3 討論

尿路梗阻所致腎積水是泌尿外科常見多發(fā)病，腎積水最終將導致腎小管間質纖維化，并直接影響腎功能衰竭[5]，研究梗阻性腎積水所致腎小管間質纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機制具有非常重要的意義。

E-cadherin是一類主要介導細胞間粘附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，是細胞粘附分子中的一種。其主要存在于人和動物的上皮細胞，參與形成和維護正常細胞間的連接，對維持正常上皮細胞形態(tài)和結構完整性起著非常重要的作用[6]。本研究中，免疫組化結果提示正常對照組腎組織表達非常豐富的E-cadherin蛋白，且其表達集中于小管上皮細胞的細胞膜及細胞相互接觸的間隙中，提示其在細胞間連接中發(fā)揮著非常重要的作用。而目前研究認為其表達下降或缺失將導致細胞極性改變容易分離，并將導致腎小管上皮細胞發(fā)生轉分化(EMT)，轉變?yōu)榧〕衫w維細胞并分泌大量細胞外基質(ECM)，直接導致腎小管間質纖維化的發(fā)生[7]。

彩超是目前臨床評價腎積水程度常用檢查手段，通過彩超檢查可以較準確地了解積水腎臟集合系統(tǒng)分離程度。本研究中通過彩超檢查評估將所有患者分為輕度、中度、中度腎積水三組，每組患者例數(shù)分別是15例、18例、17例。所有患者均經腎穿刺活檢以取得部分腎皮質行相關檢測。通過Realtime RT-PCR及Western blot檢查發(fā)現(xiàn)正常對照組腎組織表達非常豐富的E-cadherin mRNA及蛋白，而積水腎組織中其表達水平明顯下降，同時隨著積水程度的增加E-cadherin mRNA及蛋白表達水平進行性下降。將E-cadherin表達的變化趨勢與積水程度進行比較分析發(fā)現(xiàn)，E-cadherin mRNA基因及蛋白的表達變化趨勢與積水程度之間存在負相關關系，即腎積水程度的不斷加重可能是導致E-cadherin表達下降的直接原因。

我們推測其作用機制為持續(xù)的腎積水導致腎盂內壓力增高，直接作用并損害小管上皮細胞[8]，并刺激增加轉化生長因子-β1(Transforming growth factor，TGF-β1)、結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)等細胞因子的分泌，間接作用于小管上皮細胞[9]。TGF-β1及CTGF是目前公認刺激EMT發(fā)生的細胞因子，在他們的作用下腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，細胞間連接被破壞，即E-cadherin表達下降。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腎積水將通過不同機制下調E-cadherin表達，并進而通過EMT等中間環(huán)節(jié)導致腎小管間質纖維化，E-cadherin在其中起著非常重要的作用。

參考資料：

[1]Samarakoon R,Overstreet JM,Higgins SP,et al.TGF-β1→SMAD/ p53/USF2→PAI-1 transcriptional axis in ureteral obstruction-induced renal fibrosis[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):117-128.

[2]陳熾賢.實用放射學[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1998: 685-700.

[3]曹海根,王金銳.實用腹部超聲診斷學[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:238-289.

[4]Vandesompele J,De Preter K,Pattyn F,et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol,2002,3:8-12.

[5]Morcos M,SayedAA,BierhausaA,et a1.Activation of tubularepithelial cells in diabetic nephropathy[J].Diabetes,2002,51:3532-3544.

[6]Gheldof A,Berx G.Cadherins and epithelial-to-mesenchymal transition[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2013,116:317-336.

[7]Zeisberg M,Kalluri R.The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis[J].J Mol Med(Berl),2004,82(3):175-181.

[8]Sato Y,Feng GG,Huang L,et al.Enhanced expression of naofen in kidney of streptozotocin-induced diabetic rats:possible correlation to apoptosis of tubular epithelial cells[J].Clin Exp Nephrol,2010, 14(3):205-212.

[9]Chiarelli F,Gaspari S,Marcovecchio ML.Role of growth factors in diabetic kidney disease[J].Horm Metab Res,2009,41(8):585-593.

Expression and significance of E-cadherin in hydronephrosis.

LI You-kong1,ZHOU Jia-jie1,ZHANG Xian-jue1, ZHONG Wen2,GUO Hua-xiong3.Department of Urology1,Department of Endocrinology2,Department of Pathology3, Jingzhou Central Hospital,Jingzhou 434020,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of E-cadherin in different levels of hydronephrosis and investigate its clinical significance.MethodsFifty patients were enrolled in the study,with age of 18～75 years old.They were divided into mild,moderate and severe hydronephrosis groups,with 15,18 and 17 patients respectively.Fifty healthy people were selected as control group.Real time PCR and Western blot were used to detect the expression of E-cadherin mRNA and protein.Correlation analysis was applied to find out their relationships.ResultsE-cadherin was highly expressed in the control group,while its expression was low in the hydronephrosis groups.And the more severe the hydronephrosis was,the lower the E-cadherin expression level.The expression of E-cadherin was negatively correlated with the severity of hydronephrosis.ConclusionThe hydronephrosis would cause the downregulation of E-cadherin expression through many different mechanisms,and would cause tubulointerstitial fibrosis through EMT ultimately.E-cadherin playes very important roles during the process.

E-cadherin;Hydronephrosis;Tubulointerstitial fibrosis

R692.2

A

1003—6350（2014）20—2975—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.20.1171

2014-01-19)

荊州市科技發(fā)展計劃項目(編號：2011)

李又空。E-mail：liyoukong@126.com