摘要：目的 從心肌S100A4蛋白表達變化探討生泥鰍干預對游泳訓練力竭小鼠心肌的作用。方法 24只健康雄性ICR小鼠分為安靜組（C）、運動組（T）、泥鰍運動組（N），T組和N組游泳訓練3w后進行力竭運動，24h后取材檢測血清CK-MB，HE染色光鏡下觀察心肌組織，免疫組化法檢測心肌P53和S100A4蛋白的表達。結果 ①N組力竭游泳時間顯著地長于T組（P<0.01），血清CK-MB活性顯著地低于T組和C組（P<0.05）。②T組的心肌細胞界限模糊、可見心肌纖維斷裂和間質(zhì)水腫，而N組無明顯病理表現(xiàn)。③與C組比較，T組心肌P53蛋白的表達顯著增高（P﹤0.05）；S100A4蛋白N組顯著增高（P﹤0.05）。結論 負荷游泳訓練并力竭24 h后小鼠的心肌細胞存在損害，生泥鰍干預能上調(diào)S100A4表達和減弱P53表達而降低損害。

關鍵詞：生泥鰍；力竭運動；心?。籗100A4蛋白

Abstract：Objective This study was to observe effects of raw loach on myocardium by expression of S100A4. Methods 24 healthy male ICR mouse were divided into control group（C）， exercise-trained group（T）and exercise + raw loach group （N）. The exhaustive exercise time of mice was recorded after three week exercise-trained. Activity of serum MB isoenzyme of creatine kinase （CK-MB） was detected. The myocardium were observed by microscope after HE taining.The expressions of S100A4 protein were detected with immunohistochemistry. Results ①The time of exercise exhaustive were longer than group T（P﹤0.01）， the activity of CK-MM were lower than group T and C（P<0.05） in group N. ②There was not obviously tissue damage in group N. ③Compared with group C， the expression of P53 protein increased significantly in group T（P<0.05） and the expression of S100A4 protein was increased significantly in group N（PP<0.05）. Conclusion There was myocardial injury in mice with load swimming training at 24 Hours after exhaustive exercise. But raw loach can reduce the damage of myocardia by increased the expression of S100A4 protein.

Key words：Loach； Exhaustion exercise；Myocardial； S100A4 protein

泥鰍味道鮮美、氨基酸組成全面，必需氨基酸構成比例符合FAO/WHO的標準[1]，含有大量益于人體的生物活性物質(zhì)。有研究報道，泥鰍酶解蛋白、凍干粉和中藥復合劑有強身保健、抗疲勞和抗自由基保護機體作用[1-3]，而對保護運動機體的效果和機制國內(nèi)外研究極少。眾所周知，力竭運動力竭運動對心肌產(chǎn)生損害。近年研究發(fā)現(xiàn)，一種鈣結合蛋白S100A4能促血管生成和對心臟損傷起保護作用[4]。本實驗生泥鰍粉應用于游泳訓練小鼠，觀察力竭游泳能力、心肌組織及心肌S100A4蛋白表達變化，探索泥鰍保護運動機體心肌的作用與機制。

1資料與方法

1.1一般資料 健康雄性ICR小鼠，體重（20±2）g，購自湖南斯耐克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2011-0003。以國家標準嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。室溫控制在（22±2）℃，相對濕度40%～55%，光照12h/d。小鼠靜養(yǎng)與觀察3d。按體重分層隨機分為安靜對照組（C）、運動訓練組（T）、運動訓練+泥鰍組（N），每組8只。

1.2游泳訓練與力竭 運動組小鼠放入深80 cm、直徑55 cm桶內(nèi)游泳訓練，水溫（30±2）℃、水深40 cm。5d/w，下午進行，共進行3w。第1w不負重30min，第2w尾根部2%負重40min，第3w 3%負重40min。第2w開始，每天上午10點灌胃，量0.3 ml/只，C組和T組灌生理鹽水，N組灌生泥鰍溶液。訓練結束休息2d，T組和N組尾根部負重5%進行力竭游泳，記錄游泳開始至力竭的時間。力竭判斷標準：小鼠沉入水中超過10s，且放在平面時呼吸深急，神情疲倦，垂頭俯臥，刺激后無反應，無法完成翻正反射。

1.3泥鰍灌胃液制備 將生鮮市場所購活泥鰍放入水中靜養(yǎng)2～3d，清洗瀝干，加液氮速凍除頭和內(nèi)臟、剁碎，在陶瓷碾砵內(nèi)碾磨成粉，-80℃保存。參考凍干泥鰍粉的文獻有效量[2]，按2.5g/kg量用純水將泥鰍粉配制成16.67%（w/v）灌胃液。

1.4取材 小鼠力竭游泳24h后，與C組均稱取體重和麻醉，摘眼球采血分離血清，-80℃保存，檢測血清CK-MB活性。在冰上打開胸腔摘取心臟，放入預冷的冰生理鹽水中清洗，濾紙吸干水分并切取左心室心肌約3×3×3 mm置入4℃的4%多聚甲醛中，固定1w進行常規(guī)組織脫水、透明、包埋、石蠟切片。

1.5檢測指標及方法 生物化學法測定血清CK-MB活性，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，操作嚴格按說明書進行。

心肌組織HE染色：取石蠟切片3～5 μm 于二甲苯中脫蠟30 s，梯度酒精脫水30 s，蘇木精-伊紅染色1～2 min，再次梯度酒精脫水30 s，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片于光學顯微鏡（×200）下觀察。

免疫組化檢測：石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水和PBS液漂洗，置于枸櫞酸鹽緩沖液微波爐內(nèi)加熱保持140℃ 5min，室溫冷卻PBS液沖洗，3%過氧化氫孵育5min，滴加一抗工作液，置于濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜。滴加生物素標記的二抗，濕盒內(nèi)37℃孵育20min。PBS液沖洗2 min/3次，DAB顯色3～5 min。終止顯色后充分水洗，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。DAB陽性產(chǎn)物為淺棕色顆粒。在光學顯微鏡（×400）下每張切片隨機觀察6個視野，應用北航MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定蛋白表達的積分光密度（IOD）。試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。光鏡為德國LEICA公司產(chǎn)的LEICA DM LB2型雙目顯微鏡，Motic B5 顯微攝像系統(tǒng)產(chǎn)自麥克奧迪實業(yè)集團公司。

1.6統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS 19統(tǒng)計軟件進行分析，樣本均數(shù)比較組間采用獨立樣本t檢驗。P﹤0.05 為具有顯著性差異，P﹤0.01 為具有高度顯著性差異。

2結果

2.1游泳持續(xù)時間和血清CK活性 小鼠游泳至力竭時間（min） T組55.86±20.23，N組為123.52±51.65，N組非常顯著地長于T組（P<0.01），時間延長121.12%。血清CK活性（u.mL-1），C組為0.89±0.12，T組為1.00±0.37，N組為0.57±0.11。與C組比較，T組偏高（P﹥0.05），N組顯著低于C組與T組（P<0.05）。

2.2心肌細胞HE染色結果 小鼠的心肌細胞胞核呈藍色，胞質(zhì)呈紅色。C組心肌細胞界限清晰，結構正常；力竭后24 h，T組的心肌細胞界限較模糊，可見少量心肌纖維斷裂和間質(zhì)水腫；N組心肌細胞界限清晰，無心肌纖維斷裂，也無明顯間質(zhì)水腫。

2.3心肌P53和S100A4蛋白的表達 P53蛋白表達的積分光密度（IOD）C組為461.68±106.23，T組為700.94±60.15，N組為564.48±151.89。T組顯著高于C組（P﹤0.05），N組增高不顯著（P﹥0.05）。S100A4蛋白表達的積分光密度，C組為313.29±256.85，T組為452.86±168.79，N組為610.72±283.09。T組呈高于C組趨勢（P﹥0.05），N組卻顯著高于C組（P﹤0.05）和略高于T組（P﹥0.05）。

3討論

本實驗在負重游泳訓練過程中采用生泥鰍干預，小鼠力竭游泳時間延長達121.12%，與既往的研究報導一致[3，5]，無疑有必要實際應用和深入研究生泥鰍對運動機體的作用及機制。

長時間有氧疲勞運動將引發(fā)自由基產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，運動力竭可引起心肌組織中自由基增多，進而造成心肌細胞損傷[6]。一旦組織損傷組織細胞破裂，原本存在于細胞內(nèi)的物質(zhì)能在血中被檢測到，可用于反映組織損傷，其中血清CK-MB活性的升高與心肌損傷相關[7]。本實驗力竭后24 h，單純訓練小鼠可見心肌細胞病理表現(xiàn)、CK-MB活性偏高，力竭運動對小鼠心肌產(chǎn)生了一定損害。血清CK活性隨運動時間的延長顯著增加[8]，而生泥鰍粉干預小鼠游泳時間延長，24 h后活性卻明顯降低，心肌細胞無明顯病理現(xiàn)象，顯然提高了小鼠對超運動負荷的適應，發(fā)揮了保護心肌作用，這與已有的保護肝臟研究報導有一致性[3]。其保護作用，勢必與小鼠運動耐力提高密切相關。

細胞受損及其清除的另一種形式是細胞凋亡，p53蛋白是一種抑癌因子，可使內(nèi)源性Bcl-2表達下調(diào)、Bax表達上調(diào)，降低Bcl-2/Bax比值，對調(diào)節(jié)細胞凋亡過程起重要作用[9]。張鈞等報道，力竭性運動和過度訓練心肌細胞P53表達迅速增高，作為轉(zhuǎn)錄因子激活對心肌細胞凋亡調(diào)節(jié)[10]。心肌細胞P53表達變化在一定程度上可對心肌細胞損傷凋亡情況反映。本實驗中單純訓練并力竭運動小鼠心肌細胞P53表達顯著增高，可知力竭運動導致心肌損傷的凋亡過程增強。而泥鰍干預使P53增高幅度低，喻示心肌細胞凋亡過程較弱，生泥鰍對超負荷心肌組織確有保護作用。

S100A4是一種鈣結合蛋白、促腫瘤轉(zhuǎn)移因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后相關[11]。而其在心血管內(nèi)皮和心肌表達，有促血管生成，對培養(yǎng)的心肌細胞促進生長和存活作用[12]。有報道，S100A4蛋白表達上調(diào)促進損傷心肌細胞生長和存活，抑制細胞凋亡[13]。S100A4與P53蛋白的C末端區(qū)域結合，影響其亞細胞定位及轉(zhuǎn)錄活性，對細胞凋亡過程調(diào)節(jié)[14]。大鼠每天跑臺力竭訓練10d后，心肌和血管內(nèi)皮細胞空泡變性和心肌間質(zhì)水腫等，可見血管內(nèi)皮細胞凋亡特征，同時心肌和血管內(nèi)皮細胞S100A4蛋白表達顯著增高[4]。本研究顯示，訓練小鼠力竭24 h后心肌P53蛋白表達量增高，S100A4表達增高不明顯，反應訓練后一次力竭運動的心肌損害輕于反復力竭，但對抗P53降低心肌細胞凋亡損害能力較弱。而生泥鰍降低P53表達、增高S100A4表達，利于降低力竭運動后心肌細胞凋亡。

4結論

負荷游泳訓練小鼠力竭24 h后心肌細胞有損害，P53表達上調(diào)和S100A4表達較弱，對抗心肌凋亡損害作用有限。生泥鰍干預明顯提高運動耐力和降低力竭運動導致的心肌細胞損害，與上調(diào)S100A4調(diào)節(jié)使心肌細胞得到保護作用有關。

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