摘要：目的探析氯通道阻斷劑DIDS對NO誘導大鼠海馬神經元凋亡影響。方法將培養(yǎng)12d細胞采用Hoechst33258與神經元特異性抗體抗Neun抗體雙染方法鑒定成熟神經元。經過前期藥物濃度梯度監(jiān)測，確定SIN-1與DIDS的最佳濃度，最后監(jiān)測各組神經元凋亡。結果經過Hoechst33258與神經元特異性抗體抗Neun抗體雙染方法鑒定定成熟神經元純度可達到92%以上，確定SIN-1與DIDS的使用濃度為1mmol/L、0.1mmol/L。Control組有很少的凋亡細胞出現，在SIN-1組顯示有大量凋亡細胞，而在DIDS組可以觀察到少量細胞發(fā)生凋亡。結論氯通道阻斷劑DIDS可以通過某種機制減少NO誘導劑SIN-1誘導的神經元凋亡。

關鍵詞：氯通道；DIDS；海馬研究表明細胞凋亡在許多病理性神經細胞死亡所導致的疾病發(fā)揮了重要作用[1]。本實驗用NO供體SIN-1誘導大鼠海馬神經元發(fā)生凋亡，通過觀察氯通道阻斷劑DIDS對凋亡大鼠海馬神經元凋亡的影響，探討氯通道在缺血性腦損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物新生24h內 SD大鼠10只。

1.2主要試劑DMEM/F12高糖培養(yǎng)基，Neurobasal培養(yǎng)基，Anti-NeuN clone 抗體，熒光標記的二抗IgG，Hoechst33258

1.3儀器雙人雙面潔凈工作臺，倒置熒光顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱

1.4海馬神經元的鑒定參照方法用Hoechst33258和神經元特異性抗體抗NeuN抗體雙染。倒置熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.5細胞凋亡的檢測DNA熒光染色是目前常用的比較簡單的觀察細胞凋亡的方法。用DNA熒光素Hoechst33258對細胞進行染色，表現為正常細胞為藍色，凋亡細胞為淺藍色。每次隨機數三個視野內200個細胞左右，記陽性細胞凋亡（%）。

2結果

2.1用Hoechst33258DNA熒光素對神經元內細胞核進行染色（圖1a），正常海馬神經元胞核光滑，呈卵圓形，折射出染色熒光（圖1b），用特異性的神經元熒光標記物體抗NeuN抗體染色后進一步證實培養(yǎng)的細胞主要是神經元(1c)，占總細胞的92%以上。

圖1 正常條件下培養(yǎng)的新生SD大鼠海馬神經元免疫熒光觀察（200X)

2.2氯通道阻斷劑對SIN-1誘導海馬神經元損失細胞形態(tài)學觀察圖中觀察。在Control組有很少的凋亡細胞出現（14.34±2.10%），而在SIN-1組顯示有大量凋亡細胞，而在DIDS組可以觀察到有少量細胞發(fā)生凋亡。方差分析顯示各組凋亡細胞計數有統(tǒng)計學意義（F=245.471，P＜0.05）；LSD統(tǒng)計結果顯示：SIN-1組與Control組相比，P＜0.05;SIN-1+DIDS組與SIN-1組相比，P＜0.05（n=6）。

Control組SIN-1組 SIN-1+DIDS組

圖2 各組離體培養(yǎng)海馬神經元DNA熒光染色的形態(tài)學變化

3討論

目前認為缺血后的遲發(fā)性神經元的死亡主要是通過凋亡實現的。在本研究中，我們發(fā)現SIN-1作為NO供體，可以誘導海馬神經元發(fā)生凋亡，該結果與文獻報道相符。這是由于SIN-1在水中可以分解產生NO和O2-并形成OONO- [2]，過量NO和OONO-的產生可以使NO和OONO-沿不同途徑對神經元產生毒性作用。如NO和OONO-可以破壞神經元內Ca2+穩(wěn)態(tài)，另外NO供體能增加細胞內神經酰胺濃度，從而抑制BCL-2基因表達，從而誘導多種類型細胞發(fā)生凋亡。腦缺血后腦組織可以通過氧化應激，產生過量的NO，從而產生缺血性腦損傷。

有報道，Cl-穩(wěn)態(tài)遭到破壞可以導致細胞凋亡，氯通道阻斷劑DIDS能有效抑制caspase-3激活誘導的細胞凋亡[3]。在心臟缺血再灌注損傷模型中，發(fā)現DIDS可以通過p13-k/Akt途徑減弱缺血再灌注損傷所誘導的心肌細胞凋亡[4]。氯通道在神經細胞凋亡中的作用目前研究較少，在STS誘導培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經元凋亡模型上，氯通道阻斷劑SITS和DIDS對神經元的凋亡具有明顯保護作用，有學者在研究鈣通道在SIN-1誘導的大鼠海馬神經元凋亡中的作用時，發(fā)現不是鈣通道活動而是氯通道的活動參與了SIN-1誘導的神經元的凋亡。由此，我們推斷氯通道阻斷劑DIDS可能通過某種機制干預了應激狀態(tài)下的神經元的凋亡過程，對神經元起到了保護作用。

參考文獻：

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[3]張衛(wèi)衛(wèi)，劉艷.DIDS對Bcl-2/Bax在STS誘導心肌細胞凋亡中表達的影響[J].心臟雜志2009（3）：313～316.

[4]Quanzhong Chang， Shuling Zhang， Yuanyin Zheng ，et al.Effects of calcium on 3-morpholinosydnonine-induced rat hippocampal neuroal apoptosis[J].Neural Regen Res，2011，6(5):373-377.

編輯/孫杰