摘要：目的觀察人腦星形細(xì)胞瘤組織中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及其1型受體（AT1R）表達(dá)情況； 探討它們?cè)谛切渭?xì)胞瘤中發(fā)生發(fā)展中的作用。方法采用免疫組化方法檢測(cè)60例人腦星形細(xì)胞瘤手術(shù)切除組織標(biāo)本和12例健康腦組織標(biāo)本中AngⅡ及AT1R蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件行χ2檢驗(yàn)，分析它們的表達(dá)與星形細(xì)胞瘤病理分級(jí)的關(guān)系。結(jié)果60例星形細(xì)胞瘤組織中共有41(68.3%)例出現(xiàn)AngⅡ蛋白陽性表達(dá)，42例(70.0%)出現(xiàn)AT1R蛋白陽性表達(dá)，它們的陽性表達(dá)率均高于健康腦組織且有明顯差異( P < 0.05)，AngⅡ及AT1R蛋白在低病理分級(jí)和高病理分級(jí)組間表達(dá)水平也存在明顯差異( P<0.05)。結(jié)論血管緊張素Ⅱ及其1型受體在星形細(xì)胞瘤中表達(dá)率高，它們?cè)趷盒猿潭雀叩男切渭?xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于惡性程度低的星形細(xì)胞瘤組織，這表明它們的高表達(dá)可能在星形細(xì)胞瘤發(fā)生過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞：星形細(xì)胞瘤 ; 血管緊張素Ⅱ ;血管緊張素受體

AngⅡand AT1R Expression in Human Astrocytomas

WANG Yu-ting，ZHOU Chui-xian，WANG Dao-kui，WANG Jin-peng，QIN Shi-qiang

(Department of Neurosurgery，The People's Hospital of Weifang City，Weifang 261000，Shandong，China)

Abstract：ObjectiveThe expression of angiotensin Ⅱ (AngⅡ) and its type 1 receptor (AT1R) in human brain astrocytomas; To investigate the role of them in the tumorgenesis and progression of human astrocytomas. Methods 60 cases of resected glioma specimens and 12 healthy brain tissues were obtained. Their expression of AngⅡ and AT1R protein were detected by immunohistochemieal method. All the data were analyzed by SPSS13.0 statistical software package. Results41 cases (68.3%) showed AngⅡ protein expression of the 60 astrocytoma tissues， 42 cases(70.0%) had positive expression of AT1R protein， The rate of their expression in astrocytoma tissues was higher than that in healthy brain tissues and they were statistically significant(P<0.05). There was statistically significant difference among the expression of astrocytoma tissues with different histological grades. Conclusion The results indicated that the high expression of AngⅡ and AT1R may play an important role in the tumorgenesis ，especially it may do the same role in the progression.

Key words： Astrocytomas ; AngⅡ; AT1R星形細(xì)胞瘤(Astrocytoma)是發(fā)生于顱內(nèi)最常見的神經(jīng)上皮組織源性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤60%[1]，預(yù)后不佳。星形細(xì)胞瘤無論分化高低均在腦內(nèi)呈浸潤性生長。星形細(xì)胞瘤的發(fā)生和侵潤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟多階段的復(fù)雜過程，有基因突變和蛋白的異常表達(dá)等。近來研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)不僅在控制心血管功能和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡方面起著重要作用，而且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管形成并抑制腫瘤細(xì)胞分化的功能，并證實(shí)AngⅡ主要通過其位于靶細(xì)胞表面的特異性1型受體(angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R)發(fā)揮促腫瘤生長和促腫瘤血管形成作用[2]。本文以腦外傷內(nèi)減壓術(shù)時(shí)獲取的健康腦組織為對(duì)照，采用免疫組化方法檢測(cè)人腦各級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中血管緊張素Ⅱ及其1型受體的表達(dá)情況，以期探討它們?cè)谛切渭?xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1資料和方法

1.1 一般資料實(shí)驗(yàn)組：人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本60例取自濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)外科2008年1月~2009年10月手術(shù)患者的存檔蠟塊，均經(jīng)病理證實(shí)?；颊咝g(shù)前均未接受放療和化療?；颊吣挲g為5~73歲，平均為38.2歲，男35例，女25例，男女比例為1.4：1。參照WHO(1999)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將以上病例分為四個(gè)級(jí)別：Ⅰ級(jí)16例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)15例，Ⅳ14例。為了便于統(tǒng)計(jì)學(xué)描述和分析，將Ⅰ、Ⅱ級(jí)歸為低度惡性腫瘤，Ⅲ、Ⅳ歸為高度惡性腫瘤。對(duì)照組：12例對(duì)照腦組織，為腦外傷內(nèi)減壓術(shù)時(shí)取得，均經(jīng)病理證實(shí)為健康腦組織。男7例，女5例。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在性別、年齡和有無高血壓病史上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

主要試劑: 一抗：鼠抗人AngⅡ單克隆抗體及鼠抗人AT1R單克隆抗體；二抗：通用型PV-6000二步法免疫組化試劑盒。均由京中杉金橋生物公司提供。AngⅡ及AT1R在腫瘤及健康腦組織中表達(dá)的測(cè)定：腦組織標(biāo)本切下后，選取未受電凝燒灼部位，用生理鹽水沖洗干凈，放入10%中性福爾馬林溶液中固定24h，切取組織小塊，流水沖洗，放入梯度乙醇中進(jìn)行脫水，依次放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各30min將組織塊透明，然后浸蠟與包埋制成蠟塊，將蠟塊固定在切片機(jī)上后，裝上刀片，調(diào)整刀片與組織塊的傾角關(guān)系，一般為10~15°，調(diào)整切片厚度為5μm，連續(xù)切片后輕輕將其放入攤片機(jī)的展片箱中，充分展平后用防脫載玻片撈起，稍微晾干后放入烤片箱中，每個(gè)組織塊制作10張載玻片備用，從備用切片中各隨機(jī)取出1張HE染色，從備用切片中各隨機(jī)取出4張進(jìn)行免疫組化染色，免疫組化PV-6000二步法檢測(cè)AngⅡ、AT1R在組織標(biāo)本中的蛋白表達(dá)。用己知表達(dá)陽性的肝癌組織作為AngⅡ、AT1R的陽性對(duì)照，結(jié)果陽性；以正常羊血清代替一抗作為陰性對(duì)照，結(jié)果陰性；以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗為空白對(duì)照，結(jié)果陰性。

1.3結(jié)果判定

1.31 陽性結(jié)果的化學(xué)檢測(cè)：在光學(xué)顯微鏡下，以背景無顏色，細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞膜內(nèi)被染成棕黃色顆粒作為AngⅡ、AT1R蛋白陽性染色，每張切片觀察300個(gè)細(xì)胞，對(duì)其中AngⅡ、AT1R陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.32 AngⅡ、AT1R蛋白染色結(jié)果判定：參照相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]采取半定量計(jì)數(shù)法進(jìn)行評(píng)判，即在高倍鏡(400×)下隨機(jī)記錄5個(gè)高倍視野中AngⅡ和AT1R蛋白的染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞百分率的評(píng)分之和進(jìn)行評(píng)判。(1)按著色細(xì)胞染色強(qiáng)弱分：陰性為0分，弱陽性（淡黃色）為1分，陽性（黃色）為2分，強(qiáng)陽性（棕黃色）為3分。（2）陽性細(xì)胞百分率評(píng)分：以著色細(xì)胞占視野總數(shù)的多少分為陽性細(xì)胞<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，>50%為3分。根據(jù)這兩項(xiàng)指標(biāo)的積分之和分為4級(jí)：即0分為（-），1～2分（+），為3～4分（++），為5～6分為（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。以α＝0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1 AngⅡ蛋白在星形細(xì)胞瘤和健康腦組織中的表達(dá)68.33%(41/60例)的星形細(xì)胞瘤中可見AngⅡ蛋白呈陽性表達(dá)，陽性反應(yīng)顆粒廣泛分布于整個(gè)組織中，在間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中也可見到少量表達(dá)。12例健康腦組織中AngⅡ蛋白陽性表達(dá)率為8.33%(1/12例)，陽性顆粒較少。星形細(xì)胞瘤組AngⅡ蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于健康腦組織組。29例高級(jí)別星形細(xì)胞瘤（Ⅲ+Ⅳ）中有26例出現(xiàn)AngⅡ蛋白的陽性表達(dá)，明顯高于低級(jí)別星形細(xì)胞瘤（Ⅰ+Ⅱ）組（15/31例），見表1。

2.2 AT1R蛋白在星形細(xì)胞瘤和健康腦組織中的表達(dá)70.00%(42/60例)的星形細(xì)胞瘤中可見AT1R蛋白呈陽性表達(dá)，陽性反應(yīng)顆粒分布于整個(gè)組織中，在腫瘤邊緣也呈現(xiàn)過表達(dá)。12例健康腦組織中AT1R蛋白陽性表達(dá)率為25.00%(3/12例)，陽性顆粒較少。星形細(xì)胞瘤組AT1R蛋白的陽性表達(dá)率同樣明顯高于健康腦組織組。29例高級(jí)別星形細(xì)胞瘤（Ⅲ+Ⅳ）中有24例出現(xiàn)AT1R蛋白的陽性表達(dá)，明顯高于低級(jí)別星形細(xì)胞瘤（Ⅰ+Ⅱ）組（17/31例），見表2。

3討論

血管緊張素Ⅱ是一種多肽類激素，是腎素一血管緊張素系統(tǒng)的一種主要效應(yīng)分子。研究表明AngⅡ的作用是通過與其受體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制而發(fā)揮的，目前認(rèn)為ANGⅡ受體有四種亞型: AngⅡ1型受體(AT1R)、2型受體(AT2R)、3型受體(AT3R)和4型受體(AT4R)，AngⅡ的主要生物學(xué)作用是通過AT1R和AT2R介導(dǎo)的，但AT1R和AT2R在功能上是截然不同的，AT1R在促進(jìn)腫瘤血管生成方面產(chǎn)生作用，AT2R在抑制腫瘤血管生成方面產(chǎn)生作用[5-6]。

目前研究顯示，AT1R在很多腫瘤中表達(dá)增高，Takeda 等[7]用免疫組織化學(xué)方法研究表明AT1R在92%的鱗狀細(xì)胞癌中有不同程度的表達(dá)，而在77.3%的角化棘皮瘤中呈陰性，據(jù)此可鑒別鱗狀細(xì)胞癌和角化棘皮瘤。在人頭頸部和卵巢癌AT1R 過表達(dá)并和腫瘤浸潤相關(guān)[8-9] 。日本學(xué)者Fujimoto 等［10］首次研究結(jié)果顯示AngⅡ及AT1R在胰腺癌組織中表達(dá)率高，而在正常胰腺組織中表達(dá)較低，并且證實(shí)了AngⅡ在人胰腺癌細(xì)胞上的特異性結(jié)合位點(diǎn)主要為AT1R，選擇性AT1R拮抗劑能抑制AngⅡ與胰腺癌細(xì)胞的結(jié)合和胰腺癌細(xì)胞的生長。Rivera 等[11]用RT-PCR 的方法發(fā)現(xiàn)AT1R 在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)，選擇性AT1R 拮抗劑能有效抑制大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血管生成和腫瘤生長。

本研究顯示AngⅡ及AT1R蛋白在人腦星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)，他們的陽性表達(dá)率均高達(dá)60%以上，在星形細(xì)胞瘤的病理分級(jí)中， 惡性程度高的星形細(xì)胞瘤組織（Ⅲ+Ⅳ）中AngⅡ及AT1R陽性表達(dá)率均高達(dá)80%以上，明顯高于惡性程度低的星形細(xì)胞瘤組織（Ⅰ+Ⅱ），這些研究表明它們可能通過某種機(jī)制不僅促進(jìn)了星形細(xì)胞瘤的發(fā)生，而且在腫瘤的浸潤生長和惡化中起重要作用，然而它們?cè)谛切渭?xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制以及能否成為星形細(xì)胞瘤基因治療的新靶點(diǎn)，還有待于我們進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王忠誠.神經(jīng)外科學(xué)[M]. 武漢: 湖北科學(xué)技術(shù)出版社， 1998:397.

[2]Sasaki K， Murohara T， Ikeda H， eta1．Evidence for the importance of angiotensin II type 1 receptor in ischemia-induced angiogenesis[J]．J Clin Invest， 2002， 109(5): 603-611．

[3]Volm M， Koomagi R， Mattern J. Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer[J].Int J Cancer， 1997， 74: 64-68.

[4]李超，馮紅超，宋宇峰.口腔鱗癌中促血管生成素-2的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征及血管生成的關(guān)系[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21（3）:131-133.

[5]Fogarty D， Sanchez Gomez MV， Matute C， et al. Multiple angiotensin receptor subtypes in normal and tumor astrocytes in vitro[J]. Glia， 2002，39(3): 304-313.

[6]De Gasparo M，Catt KJ，Inagami T， et al. International Union of Pharmacology[M]. The angiotensin Ⅱ receptor 2000 (10) .

[7]Bergsma DJ，Ellis C，Kumar C，et al. Cloning and characterization of a human angiotensin Ⅱ type 1 receptor[J].Biochem Bioph Res Co，1992，183(3):989-95.

[8]Berk B，Corson M. AngiotensinⅡsignal transduction in vascular smooth muscle.Role of tyrosine kinases[J] .Circ Res，1997，80(5):607-616.

[9]Balla T， Baukal AJ，Eng S， et al. AngiotensinⅡreceptor subtypes and biological responses in the adrenal cortex and medulla[J].Mol.Pharmacol，1991，40:401-406.

[10]Ushio-Fukai M，Zafari AM，F(xiàn)ukui T， etal. p22phox is a critical component of the superoxide-generating NADH/NADPH oxidase system and regulates angiotensin II-induced hypertrophy in vascular smooth muscle cells[J].JBiol Chem，1996，271:23317-23321.

[11]Taniyama Y，Ushio-Fukai M，Hitomi H， etal. Role of p38MAPK and MAPKAPK-2 in angiotensin II-induced Akt activation in vascular smooth muscle cells[J].Am J Physiol Cell Physiol，2004，287:C494-C499.

編輯/王敏