摘要：目的探討miR-222在糖尿病腎病患者血清中的表達(dá)及臨床意義。方法采用qRT-PCR方法檢測(cè)35例糖尿病腎病患者和35例健康對(duì)照者血清中mi-222 的表達(dá)水平，并分析miR-222的表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果miR-222在糖尿病腎病患者血清中的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；經(jīng)相關(guān)性分析顯示，miR-222在尿毒癥組糖尿病腎病患者血清中的表達(dá)水理較非尿毒癥組明顯增高(P＜0.05)。結(jié)論miR-222在糖尿病腎病患者血清中表達(dá)上調(diào)可能參與糖尿病腎病的發(fā)病進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：miR-222；糖尿病腎??；實(shí)時(shí)熒光定量PCRmiRNA是一類長(zhǎng)度約為22nt的單鏈，非編碼RNA分子，能與靶基因3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致靶mRNA降解和翻譯阻遏[1]。miRNAs大約調(diào)控人類1/3的蛋白編碼基因的表達(dá)。miRNAs 調(diào)控重要的生物學(xué)過(guò)程，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞分化、代謝等[2]。miR-222在多種疾病中表達(dá)異常，然而在糖尿病腎?。―N）血清中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道，本次研究通過(guò)運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-222在糖尿病腎病患者血清中的表達(dá)，從而分析其與各臨床病理參數(shù)之間的意義。

1資料與方法

1.1一般資料選擇35例于2011 年8 月~2013 年7 月在南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科確診為糖尿病腎病患者作為研究對(duì)象。收集其血清標(biāo)本共35例，其中男15例，女20例；年齡35~72歲，平均（54.2±4.6）歲；DN按臨床分期分為五期，其中Ⅰ-Ⅳ期(非尿毒癥組)為21例，Ⅴ期(尿毒癥組)為14例。選取35例健康體檢的正常血清作為陰性對(duì)照。所有標(biāo)本于-80℃保存，以上標(biāo)本收集均通過(guò)衡陽(yáng)市及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署了知情同意書。

1.2主要試劑用于qRT-PCR的miRNA引物由invitrogen公司合成；RNA 抽提試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒和qRT-PCR miRNA Detection Kit購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)公司。

1.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法采用RNA抽提試劑盒提取標(biāo)本中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)為20μl體系，包括：Taq DNA polymerase 5U/μl）0.2μl，2×SYBR Mix 10μl，miRNA RT product 2.0μl， MiR-PCR primers（5μM）0.4μl，滅菌蒸餾水7.4μl。循環(huán)體系為: 95°C 3inin， 95°C 12s. 62°C 35s， 72°C 30s， 40 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，所測(cè)定的miRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-222在DN患者和健康對(duì)照者血清中表達(dá)水平的檢測(cè)收集35例DN患者和35例健康對(duì)照者血清，提取血清中總RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中miRNA-222的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，35例DN患者血清miR-222的表達(dá)水平是健康對(duì)照者的8.801倍。選取1例健康對(duì)照者血清的miR-222的值為1，然后分析得到35例DN患者血清miR-222的平均表達(dá)水平（2-△△CT）為3.582±0.146，健康志愿者血清中miR-222的平均表達(dá)水平（2-△△CT）為0.407±0.095，二者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，血清miR-222在DN患者血清中表達(dá)明顯上調(diào)。

2.2 DN患者血清中miR-222的表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系以DN患者血清中miR-222表達(dá)值的中位數(shù)為臨界值，miR-222表達(dá)值大于等于中位數(shù)者為高表達(dá)，小于中位數(shù)者為低表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-222在35例DN患者中有28例高表達(dá)（80%），17例低表達(dá)（48.6%）。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，DN患者血清中miR-222的表達(dá)與患者年齡（60歲分界）、性別無(wú)明顯相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；然而卻與患者的臨床分期相關(guān)，即miR-222在尿毒癥期DN患者血清中的表達(dá)水平高與非尿毒癥期DN患者血清中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

糖尿病腎病(DN)是我國(guó)慢性腎臟疾病的主要病因之一，是導(dǎo)致尿毒癥的第二大病因，在很大程度上促使了糖尿病患者的死亡。因此，DN 嚴(yán)重危害了糖尿病患者的健康與生命。DN一般起病隱匿，進(jìn)展緩慢，缺乏明顯的早期臨床癥狀，而臨床上出現(xiàn)蛋白尿時(shí)，其病程進(jìn)展則難以逆轉(zhuǎn)，大約50％的DN患者在7年內(nèi)發(fā)展為尿毒癥期。因此，尋找DN早期診斷的生物標(biāo)志物成為當(dāng)務(wù)之急。miRNA 作為人體天然的基因調(diào)控因子，在人類的多種生物學(xué)過(guò)程如：胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和代謝、血管的形成以及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究顯示，miRNA不僅在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而且也在血清和其他的體液中表達(dá)[3]。近年來(lái)，檢測(cè)患者外周血液中miRNA的表達(dá)用于病癥的早期診斷已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，可能成為多種病癥早期診斷的新方法。

從形態(tài)學(xué)上，糖尿病腎病主要是以腎小管-間質(zhì)纖維化，腎小球基底膜增厚，系膜外基質(zhì)增生為特點(diǎn)，從而導(dǎo)致纖維化，其主要原因是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的積聚所致。目前研究顯示，多種miRNA參與DN的發(fā)生發(fā)展，Kato[4]等研究表明miR-192在小鼠腎系膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)直接靶向sIPl促進(jìn)TGF-β 介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。研究還顯示，miRNA-216a 通過(guò)下調(diào)其靶基因YB-1，從而調(diào)控TGF-β1 的轉(zhuǎn)錄。Long[5]等證實(shí)miRNA-93 能靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)，從而使高糖環(huán)境中VEGFA 表達(dá)下調(diào)，而VEGFA在腎小球的形成和功能方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。

本次研究采用qRT-PCR 方法檢測(cè)miRNA-222在DN患者和健康對(duì)照者血清中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-222在DN組的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，且經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，尿毒癥組DN患者血清中miR-222的表達(dá)水平明顯高于非尿毒癥組DN患者，表明miR-222在DN的發(fā)病進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用，而且有可能成為DN早期診斷的生物標(biāo)志物。

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