摘要：目的 構(gòu)建α-烯醇化酶（alpha enolase，ENO1）重組表達質(zhì)粒，并研究其表達形式。方法 以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）總RNA為模板合成cDNA；根據(jù)ENO1基因序列，設(shè)計上下游引物，以cDNA為模板，經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增得到目的基因片段ENO1；用T4DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物和原核表達載體pET28(a)，獲得重組表達質(zhì)粒pET28(a)-ENO1；將pET28(a)-ENO1在BL21(DE3) E.Coli.大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，分別取菌液上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，確定重組質(zhì)粒的表達形式。結(jié)果 重組表達質(zhì)粒pET28(a)-ENO1中的ENO1測序結(jié)果與GeneBank上的序列一致；pET28(a)-ENO1以可溶性表達為主。結(jié)論 ENO1重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建及其可溶性為主的表達形式的確定，為研究ENO1的生物學(xué)活性及功能奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and Expression of α-enol Form of the Enzyme in Clinical Study of Recombinant Plasmi

NING Xing-wang1，XIE Xiao-bing1，ZHU Hui-bin1，WANG Shu-xiang1，GE Jin-wen2

(1.Medical Examination Center，The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China;2.Institute of Integrative Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China)

Abstract：ObjectiveTo construct an alpha enolase (ENO1) recombinant expression plasmid， and study its expression form. MethodsThe cDNA was synthesized using total RNA of Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) as the template. ENO1 gene was amplified from cDNA using specific forward and reverse primers by polymerase chain reaction (PCR). The recombinant expression vector was obtained by ligating ENO1 gene and pET28(a) using T4 ligase. ENO1 protein was produced by transfecting expression vector pET28(a)-ENO1 into BL21(DE3) E.Coli. and subsequent IPTG induction. The supernatant and bacteria precipitates were collected and separated by SDS-PAGE electrophoresis， respectively， to determine the expression form of the recombinant plasmid. ResultsThe sequence of cloned gene of ENO1 in the recombinant expression plasmid pET28 (a) - ENO1 was consistent with the sequence from the GeneBank; the expression form of PET28 (a) - ENO1 is soluble expression. ConclusionA kind of recombinant expression vector， pET28 (a) - ENO1， for expressing ENO1 protein was successfully constructed， and its expression form in E.Coli was also confirmed. The studies here will lay the foundation for further research on biological activity and function of ENO1 .

Key words：Alpha enolase; Prokaryotic expression; Recombinant plasmid; Expression formENO1含有434個氨基酸，在結(jié)構(gòu)上高度保守。人體內(nèi)的ENO1，表達于機體各種組織的內(nèi)皮細胞中。經(jīng)多方研究表明[1]，不同系統(tǒng)性血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等諸多自身免疫性疾病患者血清中的抗內(nèi)皮細胞抗體（anti-endothelial cell antibody，AECA）存在共同的靶抗原，其相對分子質(zhì)量為47000。經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其成分為ENO1[2]。在體內(nèi)，AECA與ENO1結(jié)合后，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡、上調(diào)粘附分子表達、增加白細胞對內(nèi)皮細胞的粘附和遷移、增加促炎癥細胞因子和趨化因子的合成和釋放以及細胞毒作用等方式引起內(nèi)皮細胞損傷和炎癥[3]，但其作用機制尚不十分明確。本研究旨在構(gòu)建α-烯醇化酶（ENO1）重組表達質(zhì)粒，并確定其表達形式，為ENO1的生物學(xué)活性及功能的進一步研究和AECA作用于靶抗原的機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料①人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心保存；② pET28(a)質(zhì)粒以及限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I購自大連寶生物；③ BL21(DE3) E.Coli.大腸桿菌是一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株，購自大連寶生物工程有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心保存。

1.2 主要實驗試劑MCDB131培養(yǎng)基、谷氨酰胺、FBS、內(nèi)皮細胞生長補充物（ECGS）購自上海鈺森生物科技有限公司；二甲基亞砜和咪唑購自sigma公司；Trizol購自invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自大連寶生物；小提質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化（北京）科技有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

2 方法

2.1 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

2.1.1 根據(jù)穆楊[4]等的研究方法，采用MCDB131培養(yǎng)基對HUVEC進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加2mmol/L谷氨酰胺、20%FBS、50μg/mL肝素和50μg/mL ECGS。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞成長到對數(shù)生長期；

2.1.2 按Trizol試劑操作說明提取HUVEC總RNA，采用大連寶生物工程有限公司的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行cDNA合成，包含基因組DNA除去反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)兩個步驟。

①基因組DNA除去反應(yīng)見表1。

點動混勻后，于42℃水浴2min，得反應(yīng)液，放置于4℃冰箱保存。

②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液在冰盒上配置。為保證反應(yīng)液配制的準確性，進行各項反應(yīng)時，先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制Master Mix（見表2），然后再分裝到每個反應(yīng)管中。

點動混勻后，經(jīng)37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5sec后，得cDNA合成產(chǎn)物，置于4℃冰箱保存。

2.2 ENO1目的基因的擴增和純化

2.2.1 PCR引物設(shè)計及合成根據(jù)GenBank中的ENO1基因序列設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

上游引物P15'CGCCATATGATGTCTATTCTCAAG 3'

下游引物P25'TCTCGAGTGCCCACAGCTTACTTG3'

其中，\"CATATG\"和\"CTCGAG\"分別為Nde I和Xho I的酶切位點。

2.2.2 ENO1目的基因的擴增 以上述逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA合成產(chǎn)物為模板，利用設(shè)計的引物進行PCR擴增目的基因ENO1，反應(yīng)條件見表3。

反應(yīng)完成后取5μl樣品上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠并進行電泳鑒定，其余放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 目的片段ENO1和載體pET28a的連接經(jīng)切膠純化得到的DNA溶液與載體pET28a經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I雙酶切后，利用T4連接酶進行連接，反應(yīng)產(chǎn)物為重組質(zhì)粒ENO1-pET28a。連接反應(yīng)體系見表4。

將連接反應(yīng)產(chǎn)物上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠并進行電泳鑒定。

2.4 重組質(zhì)粒ENO1-pET28a的表達與鑒定氯化鈣法制備BL21(DE3) E.Coli.大腸桿菌感受態(tài)細胞，將重組質(zhì)粒ENO1-pET28a進行轉(zhuǎn)化。采用天根生化（北京）科技有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒小提中量試劑盒提取轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒。按表5重組質(zhì)粒ENO1-pET28a的酶切鑒定反應(yīng)體系對提取的重組質(zhì)粒進行鑒定，將酶切反應(yīng)產(chǎn)物上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠并進行電泳鑒定。將陽性重組子菌液送大連寶生物工程有限公司測序，進一步驗證重組質(zhì)粒。

2.5 重組質(zhì)粒ENO1-pET28a的表達形式分析① 將過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌液按照1:50 的比例轉(zhuǎn)接入1L 新鮮的卡那抗性的LB 培養(yǎng)基中，室溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期；② 將1L 生長至對數(shù)中期的菌液分成兩份，每份各500mL，并向其中一份菌液中加入終濃度為0.1mM 的IPTG，另一份則作為未誘導(dǎo)的對照；③將兩份菌液繼續(xù)于室溫振蕩培養(yǎng)4 h；④ 4℃，6000 rpm 離心15min 收集菌體沉淀；⑤按照每克濕重菌體沉淀加入5mL 裂解液，充分重懸菌體沉淀；⑥加入終濃度為0.2mg/mL 的溶菌酶，混勻后冰浴中放置30min；⑦ 冰浴超聲處理5min（工作5s，停5s）；⑧4℃，12，000 rpm 離心20min分離沉淀和上清；⑨將沉淀和上清分別與1×SDS 上樣緩沖液和2×SDS 上樣緩沖液充分混勻，100℃煮沸5min；⑩待樣本冷卻后，進行10%SDS-PAGE分析。

3結(jié)果

3.1 通過HUVEC總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板擴增出ENO1基因序列，大約1305bp。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖1。

M：DNA Marker；1：陰性對照；2、3、4：PCR擴增產(chǎn)物

圖1 PCR擴增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳示意圖

3.2將酶切后的目的片段和pET28a 連接后轉(zhuǎn)種卡那抗性的固體平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后從平板上挑取8個單克隆菌落，提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定，鑒定結(jié)果顯示其中有4個克隆經(jīng)酶切后出現(xiàn)載體條帶（5，369bp左右）和目的片段條帶（1，305bp左右），即為陽性重組克隆，見圖2。將篩選的陽性重組子送大連寶生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明插入序列與數(shù)據(jù)庫中錄入的ENO1序列匹配。

M：DL15，000 bp marker；1、3和4：陽性重組子；2、5和6：空載體

圖2酶切驗證陽性重組子的1.0%瓊脂糖凝膠電泳示意圖

3.3重組質(zhì)粒小量表達后，取IPTG誘導(dǎo)表達的菌液離心，分別留取沉淀和上清液進行10% SDS-PAGE電泳分析，同時以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液作對照。電泳結(jié)果見圖3。經(jīng)分析可知，重組質(zhì)粒ENO1-pET28a主要以可溶性表達為主。

M：蛋白分子量Marker；①經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后的沉淀；②經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后的上清；③未經(jīng)誘導(dǎo)表達后的沉淀；④未經(jīng)誘導(dǎo)表達后的上清；箭頭所指為重組質(zhì)粒目標蛋白。

圖3SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒ENO1-pET28a的表達形式結(jié)果示意圖

4 討論

本實驗采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）作為總RNA的提取來源，取材簡便，且傳代培養(yǎng)方法成熟。HUVEC 是一種低增殖能力的細胞，對營養(yǎng)成分要求非常高，依照穆楊[9]等的研究，我們采用MCDB131培養(yǎng)基，并且添加ECGS，提高了細胞增殖的效率，有利于HUVEC的貼壁，倒置顯微鏡下顯示，融合效果好。

為了準確地進行基因表達量分析，必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但總RNA中常?；煊谢蚪MDNA，并可以直接作為PCR反應(yīng)的模板進行擴增，因此會造成解析結(jié)果不準確。本研究采用的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒是可以除去基因組DNA進行RT-PCR反應(yīng)的專用逆轉(zhuǎn)錄試劑。試劑盒中使用了具有較強DNA分解活性的gDNA Eraser，通過42℃，2 min即可除去基因組DNA。同時由于反轉(zhuǎn)錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分，經(jīng)過gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進行15 min的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA?？s短了合成反應(yīng)的時間，對防止RNA降解和cDNA分解起到了良好的作用。

電泳鑒定結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物為約1305bp，與預(yù)期結(jié)果一致。雙酶切后的載體pET28a被切去80bp，成線形，而未被酶切的載體成超螺旋狀態(tài)，經(jīng)過電泳，成超螺旋狀態(tài)的未酶切的pET28a泳動速度較快。應(yīng)用T4連接酶將酶切后的ENO1基因與酶切后的載體pET28a進行連接，陽性重組子經(jīng)過酶切鑒定，重組子包含目標基因大小片段和載體大小片段，經(jīng)過測序鑒定，重組子內(nèi)包含與ENO1一致的序列。本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄成功制備ENO1-pET28a重組質(zhì)粒，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

重組質(zhì)粒ENO1-pET28a經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達后，蛋白含量明顯增加；SDS-PAGE顯示上清液有一明顯的分子量大小約為47000的條帶出現(xiàn)，而沉淀中該區(qū)域含蛋白量很低，甚至缺如，因此，我們判斷重組質(zhì)粒ENO1-pET28a以可溶性表達為主。

總之，經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切和測序鑒定，本研究成果構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28(a)-ENO1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達，且確定了重組質(zhì)粒以可溶性表達為主，為進一步研究ENO1與AECA的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

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編輯/王海靜投稿小知識計量單位 文章中的年月日及各種數(shù)字一律用阿拉伯數(shù)字表示。計量單位采用1984年頒布的《中華人民共和國法定計量單位》，并用符號表示。如：m（米）、cm（厘米）、mm（毫米）、t（噸）、kg（千克）、g（克）、mg（毫克）、μg（微克）、kg/m2（千克/米2）、L（升）、ml（毫升）、d（天）、h（小時）、min（分種）、s（秒）、hm2（公頃）。