摘要：目的調(diào)查某細(xì)胞培養(yǎng)室污染情況，并進(jìn)行污染源的調(diào)查與鑒定，以了解細(xì)胞培養(yǎng)污染狀況并幫助制定行之有效的防控方案。方法對(duì)某高校及附屬醫(yī)院細(xì)胞培養(yǎng)室相關(guān)人員共74例進(jìn)行調(diào)查問(wèn)卷，同時(shí)對(duì)已被污染的細(xì)胞進(jìn)行污染源的鑒定分析。結(jié)果該細(xì)胞培養(yǎng)室污染的比例為83.8%，各種污染源均可見(jiàn)，其中以微生物污染最常見(jiàn)比率為78.4%。格蘭染色以陽(yáng)性菌為多見(jiàn)。結(jié)論該細(xì)胞培養(yǎng)室污染情況較嚴(yán)重，認(rèn)清污染的來(lái)源，采取有效措施，對(duì)于污染的預(yù)防及控制起到至關(guān)重要的作用。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng);污染;防控細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物[1]。細(xì)胞培養(yǎng)是生命科學(xué)各領(lǐng)域中一種不可或缺的科研手段。培養(yǎng)的細(xì)胞一旦遭到染菌，將具有不可逆轉(zhuǎn)性，輕則污染細(xì)胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細(xì)胞，甚至整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，給科研工作帶來(lái)嚴(yán)重的損失和威脅。本文就某細(xì)胞培養(yǎng)污染情況進(jìn)行調(diào)查并對(duì)

污染源鑒定，現(xiàn)報(bào)告如下：

1細(xì)胞培養(yǎng)污染調(diào)查對(duì)象、方法

1.1一般資料某高校及附屬醫(yī)院細(xì)胞培養(yǎng)室相關(guān)人員74例，其中博士2例，研究生66例，本科生5例，專業(yè)管理人員1例。非相關(guān)專業(yè)者未計(jì)入本次調(diào)查。

1.2問(wèn)卷調(diào)查方法

1.2.1抽樣方法對(duì)該校以及附屬醫(yī)院所有細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)人員進(jìn)行調(diào)查。要求相關(guān)人員都有過(guò)真實(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞的經(jīng)歷。

1.2.2調(diào)查問(wèn)卷本課題組設(shè)計(jì)了某細(xì)胞培養(yǎng)污染調(diào)查問(wèn)卷，內(nèi)容包括調(diào)查對(duì)象的一般情況、實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度、細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)備、操作技術(shù)、觀念意識(shí)和垃圾處理6部分。

1.2.3 調(diào)查方法用上述問(wèn)卷對(duì)同一調(diào)查對(duì)象培養(yǎng)不同批次細(xì)胞時(shí)分別進(jìn)行一次調(diào)查，同一個(gè)人共調(diào)查2次。所有問(wèn)卷調(diào)查均在發(fā)放問(wèn)卷后當(dāng)場(chǎng)完成。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄和分析。

1.3污染源鑒定

1.3.1材料革蘭染液、培養(yǎng)基、顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、培養(yǎng)箱

1.3.2方法主要對(duì)被污染的細(xì)胞及血清、培養(yǎng)液等進(jìn)行采樣并培養(yǎng)。其次對(duì)培養(yǎng)室工作臺(tái)面和二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)表面按《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中物體表面采樣方法進(jìn)行采樣和培養(yǎng)。同時(shí)對(duì)培養(yǎng)室及二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)空氣按《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中空氣采樣方法進(jìn)行采樣和培養(yǎng)；嚴(yán)格消毒后再次采樣和培養(yǎng)。

1.3.3鑒定經(jīng)格蘭染色和細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)疑似微生物污染源進(jìn)行鑒定。

2結(jié)果

2.1各類(lèi)調(diào)查問(wèn)題所示選擇答案、選擇答案人數(shù)及百分比見(jiàn)表1。

2.2 污染源鑒定結(jié)果培養(yǎng)環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物因素都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞污染。本課題小組經(jīng)過(guò)一年多的實(shí)驗(yàn)調(diào)查及鑒定發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞污染的比例為83.8%，各種污染源均可見(jiàn)，其中以微生物污染最常見(jiàn)比率為78.4%。格蘭染色以陽(yáng)性菌為多見(jiàn)。同時(shí)真菌污染也經(jīng)常發(fā)生，故在培養(yǎng)過(guò)程中可適當(dāng)加入真菌抑制劑。有時(shí)鑒定結(jié)果污染菌與人體手部正常菌群有一定的相似性。

3討論

細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)嚴(yán)格的無(wú)菌操作的過(guò)程，需要清潔的工作環(huán)境、合理的實(shí)驗(yàn)安排、實(shí)驗(yàn)人員熟練的操作技巧及強(qiáng)烈的責(zé)任感。污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問(wèn)題，培養(yǎng)的細(xì)胞作為生物體，會(huì)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作相應(yīng)的反應(yīng)，造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成巨大的威脅。

細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)環(huán)境及設(shè)備的要求很?chē)?yán)格。培養(yǎng)室中無(wú)法做到完全無(wú)菌，只能通過(guò)清潔衛(wèi)生與消毒措施盡量減少雜菌的滋生。所以應(yīng)該定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行徹底的清潔消毒，擦拭地板、臺(tái)面等，使用配制好的消毒液，常見(jiàn)的有新潔爾滅等。操作前培養(yǎng)室要徹底消毒，一般采用甲醛熏蒸法，若使用紫外燈照射消毒要達(dá)到30min，并定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒。每天用0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室要密封，避免與外界的空氣流通；保持空氣干燥，室溫不宜過(guò)高，最好保持在30℃以下。

細(xì)胞培養(yǎng)的操作是避免細(xì)胞污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，細(xì)胞培養(yǎng)人員要不斷強(qiáng)化操作技能[2]。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)溶液的好壞，不只是影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，一旦所需溶液發(fā)生污染，所有的細(xì)胞都會(huì)被污染。配制溶液時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水以避免金屬離子、有機(jī)分子等物質(zhì)對(duì)水的污染，對(duì)培養(yǎng)液配制及消毒的日期做嚴(yán)格監(jiān)控及記錄。血清、胰蛋白酶、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)輔助因子等細(xì)胞培養(yǎng)試劑及器皿在使用前進(jìn)行污染檢查。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，最好選用同一批次的血清。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑的存放于4℃的固定位置避免放射線、振動(dòng)、紫外線等物理因素的影響。血清、培養(yǎng)液、PBS等從冰箱中取出后應(yīng)放于37℃恢復(fù)溫度后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑要分開(kāi)使用（如胰酶、培養(yǎng)液等）。使用人或動(dòng)物組織源性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)需對(duì)組織進(jìn)行污染檢查。操作前所有物品用75%酒精擦拭后再移入超潔凈工作臺(tái)。盡量避免在同一時(shí)間處理不同的細(xì)胞系，如若不可避免要對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行嚴(yán)格消毒。操作時(shí)，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼；時(shí)常更換吸管，一旦吸管口接觸了手或其他污染物品應(yīng)棄去。細(xì)胞定期菌檢記錄可以降低污染引起的危害，因?yàn)槿绻l(fā)生污染，我們可以根據(jù)記錄摒棄最后一次細(xì)胞菌檢陰性后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；利用菌檢陰性的細(xì)胞重新開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)用常規(guī)檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)可以最大程度上避免污染和減低污染帶來(lái)的損失。

細(xì)胞培養(yǎng)人員要有很強(qiáng)的責(zé)任心和無(wú)菌意識(shí)。人自身通常是培養(yǎng)室中最大污染源，其衣服、體表、毛發(fā)都可能帶有大量雜菌。具有良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣是培養(yǎng)好細(xì)胞重要保證。培養(yǎng)人員進(jìn)無(wú)菌室前要用5%新潔爾滅清洗消毒手和前臂3min左右，按規(guī)定穿隔離服佩戴口罩、帽子和腳套。進(jìn)入后關(guān)好門(mén)，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)。工作開(kāi)始先用75%酒精紗布擦手和工作臺(tái)面。操作時(shí)動(dòng)作輕，盡量不談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面，避免其他人員頻繁進(jìn)入培養(yǎng)室。實(shí)驗(yàn)完畢后及時(shí)收拾，用消毒水浸泡的紗布擦工作臺(tái)面，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊。

細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)細(xì)致的科研工作，若能在細(xì)節(jié)處注意，則會(huì)避免培養(yǎng)的細(xì)胞被污染，使研究工作能夠順利進(jìn)行，避免科研經(jīng)費(fèi)的損失。

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編輯/孫杰