摘要：目的 探討同型半胱氨酸（homocysteine， Hcy）磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN）啟動子區(qū)DNA甲基化的影響。方法 原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞（VSMCs），100 M Hcy刺激48h后，以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測PTEN mRNA 表達水平的變化，western blot檢測PTEN蛋白表達變化；生物信息學(xué)分析PTEN啟動子區(qū)CpG島，巢式降落時甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測PTEN DNA甲基化水平。結(jié)果 與正常對照組相比（0 M Hcy），給予100 M Hcy刺激后，VSMCs中PTEN mRNA 及蛋白表達水平均降低；其啟動子區(qū)存在數(shù)個CpG島，其DNA甲基化水平升高。結(jié)論 Hcy可下調(diào)VSMCs中PTEN的表達，而PTEN DNA啟動子區(qū)的高甲基化可能在這一過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；PTEN；DNA甲基化；血管平滑肌細胞；動脈粥樣硬化

血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖等改變是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心環(huán)節(jié)。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是AS的獨立危險因子[1]，可以促進VSMCs的增殖[2]。磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN） 在細胞的生長、存活、遷移、分化等過程中發(fā)揮了重要作用。但Hcy是否通過影響PTEN DNA甲基化影響其在血管平滑肌細胞的表達目前未見報道。本研究用Hcy干預(yù)VSMCs，檢測PTEN mRNA、蛋白表達其啟動子區(qū) DNA甲基化水平，為今后研究Hcy導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展機制打下基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細胞由本實驗室培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；DNA抽提試劑盒購自北京百泰克；DNA甲基化修飾試劑盒購自美國ZYMO RESEARCH；兔抗人PTEN抗體、兔抗β-actin、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG 購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細胞人臍靜脈平滑肌細胞培養(yǎng)與鑒定 采用于海嬌[2]等方法培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)的人臍靜脈平滑肌細胞。

1.2.2熒光定量PCR檢測PTEN mRNA的表達 將上述轉(zhuǎn)染pEGFP-PTEN的細胞用TRIzol法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為c-DNA行熒光定量PCR檢測PTEN mRNA的表達。以GAPDH為內(nèi)參照，根據(jù)PCR儀自動生成的Ct值，根據(jù)公式計算目的基因的相對量：相對表達量=2-△△Ct。

1.2.3 western blot檢測PTEN 蛋白的表達 按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗膜；1：500 稀釋的抗PTEN 蛋白抗體，1：1000 稀釋的抗β-actin抗體 4℃孵育過夜，TBST洗膜；辣根過氧化物酶（1：3000）室溫標(biāo)記1 h，TBST洗膜；凝膠成像系統(tǒng)分析，以β-actin 蛋白為內(nèi)參，用PTEN與β-actin條帶像素灰度的比值表示PTEN 蛋白的相對表達量。

1.2.4巢式降落式甲基化特異性 PCR（nMS- PCR）檢測PTEN啟動子區(qū) DNA 甲基化程度 根據(jù)DNA 提取試劑盒說明書提取基因組 DNA，用亞硫酸鹽修飾法對 DNA 進行修飾，設(shè)計外引物及甲基化引物（M）及非甲基化引物（U），PTEN外 引 物 上 游：5'-TTGGAAAGTTTTTT AATTAGGGATA-3'， 下游：5'- TTTCAAAAACCCAAA AAACAC-3'，產(chǎn)物長度為445bp；M上游：5'-GTGATTTTT TTCGGAAAGTAGTTTC-3'，下游：5'-TAAAAACC CGACAAA ATAAATCG-3'；U上游：5'-ATTTTT TTTGGAAAGTA GTTTTGA-3'，下 游：5'-AAAACCCA ACAAAATAAATCACC-3'。甲基化產(chǎn)物為211bp，非甲基化產(chǎn)物為207 bp，反應(yīng)后取終產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳，分析光密度，按如下公式進行結(jié)果的計算：甲基化（%）=OD甲基化/OD甲基化+OD非甲基化]。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果以x±s表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗進行兩樣本間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1原代人臍靜脈平滑肌細胞培養(yǎng)與鑒定 細胞培養(yǎng)第8d時，相差顯微鏡下可看到長梭形細胞從組織塊邊緣萌出，此后細胞沿貼塊周圍放射狀生長；培養(yǎng)12d左右，細胞成束平行排列，高低起伏，呈現(xiàn)平滑肌細胞特征性的\"峰\"、\"谷\"狀生長。經(jīng)α-actin免疫細胞化學(xué)染色后98%的細胞呈陽性，即胞漿呈細顆粒狀棕黃色沉淀，細胞核為淡藍色。

2.2 Hcy對PTEN mRNA及蛋白水平的影響 Hcy干預(yù)VSMCs后，分別檢測PTEN mRNA及蛋白表達水平，結(jié)果顯示與對照組相比，Hcy干預(yù)組mRNA及蛋白水平表達降低（P<0.01）（圖1）。

2.3生物信息學(xué)分析PTEN啟動子區(qū)CpG島 選取PTEN基因上游2200bp作為研究對象， 生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)PTEN啟動子區(qū)含有5個CpG島，提示PTEN基因很可能受到甲基化的調(diào)控。

2.4 Hcy對PTEN甲基化程度變化的影響 用Hcy 干預(yù)的VSMCs，利用ntMS-PCR法檢測PTEN甲基化程度變化，如圖2所示，結(jié)果顯示與Control組比，Hcy干預(yù)組PTEN甲基化程度明顯升高（P<0.01）。

3討論

PTEN作為一種多功能的調(diào)節(jié)因子，近年來在AS中的作用越來越受到關(guān)注。PTEN 基因可以通過作用于上游的重要增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制VSMC 增殖和遷移，且增加誘導(dǎo)其凋亡[3]。而本研究發(fā)現(xiàn)Hcy能夠下調(diào)PTEN mRNA和蛋白水平的表達，提示Hcy通過調(diào)節(jié)PTEN的表達參與了VSMCs的增殖。

DNA甲基化是表遺傳范疇的重要內(nèi)容之一，一般來說，基因啟動子區(qū)的DNA高甲基化意味著基因的沉默，而低甲基化表示基因的激活。DNA甲基化一般發(fā)生在CpG聚集的地方，特別是在CpG 島上。在AS形成中，國內(nèi)外先后報道了LDL受體等[4]的DNA甲基化改變。本課題組前期研究在人臍靜脈細胞培養(yǎng)的過程中加入臨床相關(guān)濃度的Hcy培養(yǎng)，觀察到全基因組、ApoE等基因低甲基化現(xiàn)象。本研究利用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)PTEN啟動子區(qū)存在5個CpG島，提示PTEN基因很可能受到甲基化的調(diào)控。而用Hcy 干預(yù)VSMCs后發(fā)現(xiàn)PTEN啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化變化。以上結(jié)果提示Hcy影響了PTEN啟動子區(qū)甲基化程度變化，使其高甲基化，從而導(dǎo)致了其低表達，參與了VSMCs的增殖過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Hcy可以使 VSMCs中PTEN的表達下調(diào)，而PTEN DNA啟動子區(qū)的高甲基化可能在這一過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。

參考文獻：

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[4]Huang Y.ifferent effects of homocysteine and oxidized low density lipoprotein on methylation status in the promoter region of the estrogen receptor alpha gene. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai），2007，39（1）：19-26.

編輯/申磊