摘要：目的 建立測定痛經(jīng)康口服液中原兒茶醛含量的高效液相色譜法方法。方法 采用高效液相色譜法，ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（ 4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸（20：79.5：0.5），檢測波長280 nm，流速為1.0mL/min，柱溫為室溫。結(jié)果 原兒茶醛在0.025 ～ 0.5μg范圍內(nèi)進(jìn)樣與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=1.0000）。原兒茶醛平均回收率為101.1%， RSD=2.29%。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高效液相色譜法測定原兒茶醛含量，方法快速，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便，可用于本產(chǎn)品質(zhì)量研究。

關(guān)鍵詞：痛經(jīng)康口服液；原兒茶醛；高效液相色譜法

本實(shí)驗(yàn)中的痛經(jīng)康口服液是中山市人民醫(yī)院研究自制，由當(dāng)歸、川芎、丹參、紅花、桃仁等12味中藥組成的復(fù)方內(nèi)服液體制劑，該方具有養(yǎng)血活血，調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛的功效。由于該產(chǎn)品現(xiàn)還處于研制階段中，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚欠完善，缺乏確切的量化指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選用較常用的反相高效液相色譜法，以適宜的色譜條件將痛經(jīng)康口服液中原兒茶醛與其他組分分離，建立檢測該制劑中原兒茶醛（C7H6O3）含量的方法。

1 材料與儀器

Agilent1200系列高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）：在線真空脫氣裝置G1322A、四元泵G1311A、檢測器G1314B、自動(dòng)進(jìn)樣器G1329A、Agilent化學(xué)色譜工作站，超聲波清洗器，萬分之一電子天平。

痛經(jīng)康口服液由中山人民醫(yī)院制劑室提供；原兒茶醛購自中國藥品生物制品檢定所。所用試劑均為AR級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0. 6%甲酸（20∶80）；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：322nm；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：室溫。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶醛對(duì)照品2.5mg置于100ml量瓶中，加人甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為25μg·ml-1的溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密量取15ml樣品溶液，置100ml錐形瓶中，精密加入甲醇15ml，超聲（150w，50kHz）處理20min，放冷，搖勻，靜置，取上清液，過微孔濾膜（0.45L），即得供試品。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方比例，制備缺味中藥（丹參）的陰性空白樣品對(duì)照液，照上述2.2.2項(xiàng)下制備方法制成空白對(duì)照溶液。

2.3方法學(xué)的考察

2.3.1線性關(guān)系考察 精密稱取原兒茶醛對(duì)照品（25μg·ml-1）適量，按上述2.2.1項(xiàng)下配制溶液，如上述2.1項(xiàng)下色譜條件，取1， 2.5， 5， 10，15， 20μl，分別注人液相色譜儀，記錄色譜圖數(shù)據(jù)，見表1。

以峰面積Y對(duì)濃度X（μg·ml-1）進(jìn)行線性回歸，作圖（見圖1）得回歸方程Y=-0.46+31.693X，相關(guān)系數(shù)R2=1， 表明原兒茶醛在0.025～0.5μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2專屬性考察 照上述色譜條件，精密吸取陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μl，分別注人高效液相色譜儀，見圖2。

結(jié)果表明，在原兒茶醛出峰的時(shí)間，無干擾峰存在。由對(duì)比A、B、C三組色譜峰圖可證明，在此方的藥材中，原兒茶醛專屬丹參藥材含有。具有專屬性意義。

2.3.3精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（濃度為0.025μg·ml-1）10μl， 如上述2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，原兒茶醛峰面積積分值的RSD為0.14%。見表2。

由結(jié)果可知，RSD%=0.14%〈0.5%，此方法測定含量的精密度較為良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液10μl，按上述2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測原兒茶醛的峰面積，得供試品原兒茶醛含量的平均值為42.53μg·ml-1，RSD=0.43%。見表3。

由結(jié)果可知，RSD%=0.43%<0.5%，此方法測定含量的重現(xiàn)性較為良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1ml， 精密加入原兒茶醛對(duì)照品溶液（25μg·ml-1）2 ml，用50%甲醇定容至10ml，按上述方法重復(fù)配液6份。再按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μl，共6次，記錄峰面積，求回收率，見表4。

由結(jié)果可知，回收率為101.1%，在中藥制劑含量測定的回收率范圍95%～105%內(nèi)，回收率的RSD（%）=2.3%<3%，在規(guī)定的允許范圍內(nèi)?？傻么撕繙y定方法的準(zhǔn)確度較高。

2.4樣品的含量測定 同法制備樣品3批，分別按上述2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品得3份，再如上述2.1項(xiàng)下色譜條件各重復(fù)進(jìn)樣3次，測定供試品中原兒茶醛的峰面積記錄及處理（見表5）。按上述方法測定3批樣品中原兒茶醛的含量（μg·ml-1）分別為84.81，85.31，85.94；平均含量（μg·ml-1）為85.35。

3 結(jié)論

本法建立了反相高效液相色譜法測定痛經(jīng)康口服液中原兒茶醛成分，方法簡單可行，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于該類制劑鑒別和質(zhì)量控制。

4 討論

4.1前處理方法

4.1.1醇沉濃度的選擇 對(duì)丹參水溶性成分的測定多見于HPLC法對(duì)注射劑中原兒茶醛等的測定[1，2]，有文獻(xiàn)[3]報(bào)道，通過比較得出10%甲醇溶液為較理想的樣品提取溶液，不但提取效率最高，而且樣品溶液中丹參素和原兒茶醛峰與其他相關(guān)雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離。而另有文獻(xiàn)表示，不同醇沉濃度對(duì)丹參有效成分含量影響也較大，而50%醇沉法在沉去大量雜質(zhì)同時(shí)，各有效成分基本不損失[4]。考慮到本復(fù)方口服液制劑是先通過水煎煮提取的，成分極復(fù)雜，而丹參的主要成分以水溶性成分為主。本實(shí)驗(yàn)分別采用50%、60%和70%醇沉濃度按2.2.2項(xiàng)下前處理發(fā)現(xiàn)，采用50%醇沉最適宜，原兒茶醛峰與其他相關(guān)雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離（如圖2B）；其他兩個(gè)濃度使測定成分損失極為嚴(yán)重，幾乎無檢測峰。實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)的前處理方法可行。

4.1.2萃取方法的討論 陸一菱等[5]曾通過比較乙醚和乙酸乙酯-無水乙醇（4∶1）2種萃取溶劑。得出乙醚對(duì)原兒茶酸和原兒茶醛的萃取效率均較高，且提取雜質(zhì)較少，可減少對(duì)分析柱的污染。鑒于HPLC具有良好的分離系統(tǒng)，故本實(shí)驗(yàn)取消萃取方案，按2.2.2項(xiàng)下只用50%醇沉除雜，精濾后得供試液直接用于測定。從圖2（B）可知，原兒茶醛峰與其他相關(guān)雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，提取方法可行。但是這樣制得的供試液雜質(zhì)多，對(duì)分析柱的污染也較大。為了提高效率，縮短時(shí)間，可先用流動(dòng)相溶劑系統(tǒng)中的100%甲醇洗脫殘余雜質(zhì)15min，殘余雜質(zhì)洗脫完全，基線很快可以恢復(fù)穩(wěn)定。再改成流動(dòng)相甲醇-0.6%甲酸（20∶80）洗脫10min，基線仍維持穩(wěn)定狀態(tài)，即可操作下一次的進(jìn)樣。

4.2檢測波長的選擇 原兒茶醛在230nm、279nm、312nm波長處有最大吸收峰。袁冬梅等[6]將之比較發(fā)現(xiàn)，在279nm處，噪音信號(hào)較小，而且流動(dòng)相在該波長的背景吸收較低，因而本實(shí)驗(yàn)在儀器誤差（±2nm）允許范圍內(nèi)，選擇280nm為檢測波長。

4.3流動(dòng)相選擇 實(shí)驗(yàn)中主要對(duì)流動(dòng)相的溶劑系統(tǒng)的組成比例進(jìn)行了選擇。有參考文獻(xiàn)[7]采用水-甲醇-甲酸（81. 5∶18∶0. 5）為流動(dòng)相，通過多次調(diào)整甲醇-0.6%甲酸的比例（18∶82）， （15∶85）， （20∶80），（22∶78）比較得出：本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-0.6%甲酸（20∶80）作為流動(dòng)相較好， 原兒茶醛的峰形尖銳， 且能與雜質(zhì)峰達(dá)到良好的分離，出峰時(shí)間9.5min左右，分析1個(gè)樣品只需12min，故選用此流動(dòng)相。

由于原兒茶醛為有機(jī)酚酸類化合物，易電離，用色譜法分析常會(huì)出現(xiàn)譜峰拖尾、變寬或不對(duì)稱現(xiàn)象。而在流動(dòng)相中加入酸性物質(zhì)可以抑制此類化合物的電離，改善峰形。文獻(xiàn)報(bào)道將流動(dòng)相的pH調(diào)節(jié)為2.80左右為宜。故本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相系統(tǒng)組成中，將水加入適量的甲酸調(diào)酸，配成0.6%甲酸溶液，峰形對(duì)稱，尖銳。在調(diào)整過程中，隨流動(dòng)相中甲醇比例的增加，原兒茶醛的出峰時(shí)間均提前，色譜峰前移。因?yàn)?，混合溶劑的極性是由它的各組分根據(jù)其所占份額而貢獻(xiàn)的極性之和，極性參數(shù)由公式Pab'=φaPa'+φbPb'（其中甲醇和水的極性參數(shù)P'分別為5.1和10.2）。

4.4原兒茶醛的穩(wěn)定性 原兒茶醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)是3，4-二羥基苯甲醛，含有相鄰酚羥基，并且還含有醛基，這2種官能團(tuán)易被氧化并發(fā)生縮合反應(yīng)。因此，當(dāng)用萃取方法時(shí)用36%濃鹽酸調(diào)pH1.0～2.0酸化環(huán)境，90℃水浴蒸干，盡可能縮短在空氣中的暴露時(shí)間，可減少其被氧化的幾率。而且原兒茶醛對(duì)光不穩(wěn)定，故本制劑的供試品溶液及對(duì)照品溶液需避光貯存。為求實(shí)驗(yàn)的平行性，陰性對(duì)照溶液也需要同樣處理。

參考文獻(xiàn)：

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[3]阿布都卡哈爾，尼加提.阿不來提，阿依努爾.HPLC同時(shí)測定香丹注射液中丹參素和原兒茶醛的含量[J].新疆中醫(yī)藥，2008，26（2）：47-48.

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編輯/哈濤