[摘 要] 在《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388-2008）的基礎(chǔ)上，對生鮮乳中三聚氰胺提取和復(fù)溶步驟略作改進，達(dá)到操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。以檢測限500～1000倍做添加，用1%三氯乙酸作為提取溶劑，采用渦旋震蕩的方式輔助溶劑萃取法提取生鮮乳，提取液用Waters Oasis MCX固相萃取柱進行凈化濃縮，氮氣吹干后再用流動相做同等倍數(shù)的稀釋。以Waters ACQUITY BEH HILIC色譜柱為分離柱，在正離子模式下以電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定。對流動相組分和流動相添加劑對質(zhì)譜的離子化進行考察，在2.0～20.0ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.99），樣品在10.0μg/kg的添加水平上回收率為85%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%。本方法能夠克服生鮮乳中三聚氰胺檢測時基質(zhì)干擾大，影響定量準(zhǔn)確度的問題。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜- 電噴霧質(zhì)譜/ 質(zhì)譜 三聚氰胺 生鮮乳 GB/T 22388-2008

[中圖分類號] S827 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1003-1650 （2014）10-0151-01

三聚氰胺（化學(xué)式：C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，常溫下呈白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類。作為化工原料，三聚氰胺與甲醛縮合聚合可制得三聚氰胺樹脂，主要用于塑料及涂料工業(yè)，也可作紡織物防摺、防縮處理劑；其改性樹脂可做色澤鮮艷、耐久、硬度好的金屬涂料；還可用于堅固、耐熱裝飾薄板，防潮紙及灰色皮革鞣皮劑，合成防火層板的粘接劑，防水劑的固定劑或硬化劑等；部分亞洲國家，也被用來制造化肥。

三聚氰胺的最大的特點是含氮量很高（66%），加之其生產(chǎn)工藝簡單、成本很低，給了摻假、造假者極大地利益驅(qū)動，食品中三聚氰胺每增加一個百分點，通過凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)會虛長4個百分點，費用只有真實蛋白原料的1/5，所以“增加”產(chǎn)品的表觀蛋白質(zhì)含量是添加三聚氰胺的主要原因。但是，中國國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心明確指出，三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的。

2008年三聚氰胺奶粉事件后，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會在原有國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上發(fā)布了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388-2008），該標(biāo)準(zhǔn)涉及高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜3種檢測方法，3種方法的定量限分別為2mg/kg、0.05mg/kg和0.01mg/kg。

本文所采用的方法較GB/T 22388-2008中的液質(zhì)聯(lián)用法前處理更為簡便，能有效消除基質(zhì)干擾，定量限更低，更適用于當(dāng)前實驗室檢測。

一、實驗部分

1.儀器與試劑

Xevo TQ-S型串聯(lián)質(zhì)譜儀，配I-Class型超高效液相色譜儀，美國Waters公司；固相萃取裝置（美國 Waters公司）；多管渦旋振蕩器（北京 TARGIN）；高速冷凍離心機（德國 Hermle）；十萬分之一天平（XS205，瑞士 METTLER-TOLEDO）；百分之一天平（TE612-L，德國 Sartorius）；氮吹儀（美國 Organomation Associates Jnc. N-EVAPTM 112）；0.22μm微孔濾膜（津騰，德國MEMBRANA公司原產(chǎn)膜）；1mL無菌注射器。

三聚氰胺對照品（純度：99%，上海安譜公司）；甲醇、乙腈均為HPLC級別（美國Fisher公司）；三氯乙酸、氨水為分析純（天津科密歐）；實驗室用超純水（娃哈哈瓶裝純凈水）；Oasis MCX固相萃取柱（60mg/3cc，美國Waters公司）；0.22μm微孔濾膜；1mL無菌注射器。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/mL）：精密稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用20%甲醇水溶液溶解并定容至100mL，-20℃保存。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線：將100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液經(jīng)過分步稀釋成濃度為2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL和20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線，稀釋液為70%乙腈水溶液。

三聚氰胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要吸取適量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液加至“1.3 樣品的提取和凈化”中的空白樣品洗脫液中。

3.樣品的提取和凈化

準(zhǔn)確稱取空白樣品2g（精確至0.01g）于50mL塑料離心管中，加入10mL1%三氯乙酸溶液，置于多管振蕩器上渦旋20min，以每分鐘8000轉(zhuǎn)的速度離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一10mL塑料離心管中，待凈化。

取MCX固相萃取柱，分別經(jīng)3mL甲醇和3mL水活化后，準(zhǔn)確移取帶凈化上清液5mL通過固相萃取小柱，然后依次用3mL水、3mL甲醇淋洗小柱，控制流速為1mL/min，最后用5%氨化甲醇5mL洗脫固相萃取柱，洗脫液收集于10mL離心管中。將洗脫液置于50℃水浴中氮氣濃縮至干，加1.0mL70%乙腈水溶液充分溶解，用0.22μm微孔濾膜過濾后供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測。

注：同時做空白1個、基質(zhì)空白5個（用于制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液）、空白添加14個。

4.色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH HILIC 2.1×100mm，1.7μm（Waters）

柱溫：30℃；樣品室溫度：10℃；進樣量：2μL

流動相及洗脫條件：流動相A ：超純水（30%）；流動相B：乙腈（70%）；以0.6mL/min的流速等度洗脫，保持3min。

5.質(zhì)譜條件

Polarity：ES+

Capillary （kV） 3.40

Cone （V）46.00

Source Offset （V）50.0

Source Temperature （°C） 150

Desolvation Temperature （°C）450

Cone Gas Flow （L/Hr）150

Desolvation Gas Flow （L/Hr）1000

Collision Gas Flow （mL/Min）0.15

Nebuliser Gas Flow （Bar）7.00

LM 1 Resolution2.8

HM 1 Resolution14.7

LM 2 Resolution2.8

HM 2 Resolution14.6

6. 質(zhì)譜采集參數(shù)（見表1）

表1：三聚氰胺的監(jiān)測離子及質(zhì)譜采集參數(shù)

*定量離子

二、結(jié)果與討論

本文較GB/T 22388-2008在前處理上略有改進，不需要進行過濾處理。此外，本文與GB/T22388-2008的最大不同之處在于添加和復(fù)溶兩個步驟上。本人按照GB/T22388-2008的要求進行添加試驗，經(jīng)過反復(fù)驗證，并通過基質(zhì)添加定量的方式進行校正，發(fā)現(xiàn)直接定量的準(zhǔn)確度很低，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線更是達(dá)不到線性要求（R2僅為0.73），這是由于基質(zhì)干擾較大造成的，此定量方式不適用。基于以上的試驗，本人在初始添加時即將添加濃度提高至檢測限的500～1000倍，經(jīng)提取凈化、氮氣濃縮，在復(fù)溶時，用流動相做同樣倍比的稀釋，在曲線線性關(guān)系良好（R2>0.99）的基礎(chǔ)上對添加進行定量（見圖1），在10μg/kg的添加水平上回收率在85%～97%之間，RSD為3.0%（n=14）。通過不同濃度的添加來確定本方法檢測最低限，經(jīng)試驗數(shù)據(jù)確定本方法檢測限為3.0μg/kg。因此，本人認(rèn)為，此方法操作簡單，能很好的消除基質(zhì)干擾，檢測限更低，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于實驗室生鮮乳中三聚氰胺殘留檢測。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線