摘要 [目的]加密玉米SSR遺傳連鎖圖譜，對玉米粗縮病抗性QTL進(jìn)行精確定位分析。[方法]以（80007×80044）F9 ∶10為作圖群體，在實(shí)驗(yàn)室前期建立的SSR遺傳圖譜基礎(chǔ)上，將檢測到的新的87個標(biāo)記加密到遺傳圖譜中，最終構(gòu)建包括260個位點(diǎn)的遺傳連鎖圖譜；同時將RIL群體衍生的195個F9 ∶10家系進(jìn)行田間抗病性狀鑒定，采用完備區(qū)間作圖方法（ICIM）對玉米粗縮病抗性進(jìn)行QTL的定位分析。[結(jié)果]圖譜總長度1 170 cm，標(biāo)記間平均距離4.50 cm；在濟(jì)寧環(huán)境條件下定位到1個QTL，表型變異貢獻(xiàn)率為9.57%，可作進(jìn)一步的精細(xì)定位和克隆。[結(jié)論]該試驗(yàn)對玉米粗縮病抗性QTL進(jìn)行了精確定位分析，為玉米SSR遺傳連鎖圖譜研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 玉米；SSR；遺傳連鎖圖譜；粗縮??；數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）

中圖分類號 S513 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）17-05348-04

Abstract [Objective] To increase density of maize SSR genetic linkage map， QTL for resistance to maize rough dwarf disease was identified. [Method] A mapping population consisting of 195 F9 ∶10 recombinant inbred lines（RILs） derived from the cross between maize inbred lines 80007 and 80044 was used in this study. Based on the genetic linkage map in our laboratory， 117 pairs of markers were screened polymorphism between the parents in 430 pairs of new SSR markers， and 87 pairs of these were used to increase density of genetic linkage map. The final map included 260 polymorphic SSR markers. [Result] The total genetic length was 1 170 cm with an average interval distance of 4.50 cm. One QTL for MRDD was identified in Jining environment， explaining 9.57% of the phenotypic variation， which could be used for fining mapping and positional cloning. [Conclusion] QTL for resistance to maize rough dwarf disease was identified and analyzed， which will provide basis for study on maize SSR genetic linkage map.

Key words Maize； SSR； Genetic linkage map； MRDD； Quantitative trait locus

玉米粗縮?。∕aize Rough Dwarf Disease，MRDD）是一種世界性的玉米病害，嚴(yán)重影響全球玉米生產(chǎn)。自1954年在我國新疆南部和甘肅西部等地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)玉米粗縮病以來，在我國各玉米產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)生，現(xiàn)已蔓延至黃淮海、華北、西北和東北的大部分玉米產(chǎn)區(qū)。在我國，導(dǎo)致玉米粗縮病的主要病原是水稻黑條矮縮病毒（Rice Black Streaked Dwarf Viral，RBSDV）[1]，其主要傳毒媒介為灰飛虱[2-3]。近年來，隨著氣候環(huán)境的變化和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，全國（尤其是黃淮海地區(qū)）玉米粗縮病的發(fā)生呈明顯上升趨勢[4]。1996年河北省爆發(fā)玉米粗縮病，發(fā)病面積達(dá)75.6萬hm2，造成了大幅度減產(chǎn)和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。2008年江蘇省發(fā)生面積達(dá)15.7萬hm2，占江蘇玉米種植面積的40%[6]。自2005年以來山東省連續(xù)多年嚴(yán)重發(fā)生玉米粗縮病，其中2008年到2011年連續(xù)4年發(fā)病面積均高于80萬hm2，主要發(fā)生在臨沂、棗莊、泰安、濟(jì)寧等地區(qū)，發(fā)病較重的地塊病株率一般為20%～30%，個別地塊可達(dá)70%～80%，嚴(yán)重的地塊甚至絕收[7-8]。粗縮病已經(jīng)成為我國主要玉米病害之一，對玉米生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，粗縮病的防治基本上采取農(nóng)業(yè)防治為主，化學(xué)防治為輔的綜合防治策略。調(diào)整播期和化學(xué)防治等雖然在一定程度上能夠控制粗縮病的發(fā)生和傳播，但均不是理想的防治措施。培育抗病品種是防治玉米粗縮病最行之有效的方法，但常規(guī)育種方法培育抗病品種周期長，抗病性鑒定又受環(huán)境影響較大，大大增加了抗病育種的工作難度。利用玉米粗縮病抗性QTL進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可以不受時間及環(huán)境的限制，能加速抗粗縮病玉米育種的工作進(jìn)程，對于實(shí)現(xiàn)病害的持久防治具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對玉米粗縮病抗性QTL定位的研究報(bào)道很多，利用不同群體檢測到多個抗性QTL，幾乎在玉米10條染色體上均有抗性QTL被檢測到[9-17]，這些研究對闡明玉米粗縮病的遺傳機(jī)制起到了一定作用。但由于不同研究所用的群體類型和大小、遺傳背景、遺傳圖譜密度及統(tǒng)計(jì)分析方法的不同，同一性狀定位的QTL存在著數(shù)目、位置及效應(yīng)方面的差別，并且難以定位到在多種環(huán)境條件下均能穩(wěn)定表達(dá)、且效應(yīng)較大的QTL，從而限制了研究結(jié)果在育種中的應(yīng)用。如，史利玉等在2007年的研究中，玉米自交系黃早四作為抗病材料，但在2011年的鑒定結(jié)果卻為感病材料[10，13]，玉米材料抗病鑒定的不穩(wěn)定性對玉米粗縮病QTL定位分析造成嚴(yán)重影響。實(shí)驗(yàn)室以（80007×80044）F5 ∶6為群體材料，構(gòu)建了包含173個位點(diǎn)的遺傳連鎖圖譜，在泰安和肥城環(huán)境下共檢測到8個QTL，分別位于第1、2、5號染色體上。為進(jìn)一步確定抗病材料的穩(wěn)定性，筆者以（80007×80044）F9 ∶10為群體材料，在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加密玉米SSR遺傳連鎖圖譜，并對玉米粗縮病抗性QTL進(jìn)行精確定位分析，以期為抗玉米粗縮病分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種及抗粗縮病基因的精細(xì)定位和克隆提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 構(gòu)建群體的親本為玉米自交系80007和80044。2007年以抗玉米粗縮病的自交系80007為母本，感病自交系80044為父本配制雜交組合，以F2為基礎(chǔ)采用單粒傳種法，經(jīng)過連續(xù)多代自交構(gòu)建了RIL群體，作為性狀遺傳分析的供試群體。

1.2 田間試驗(yàn) 將RIL群體及其親本于2013年分別種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)站和山東省濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)站，每個家系種植25株。確定播期使玉米苗期的感病階段與灰飛虱成蟲的遷飛盛期相遇。2個環(huán)境下的群體材料均常規(guī)栽培管理，使其田間自然感病。

1.3 田間抗病性調(diào)查 在玉米成株期，參照路銀貴等[18]的方法分成1、3、5、7、9共5個等級對群體進(jìn)行玉米粗縮病病情調(diào)查。在分級調(diào)查病情的基礎(chǔ)上，計(jì)算行發(fā)病率。行發(fā)病率（%）=∑（發(fā)病等級×該等級植株數(shù)）×100/（最高發(fā)病等級×總植株數(shù)）。

1.4 DNA提取及SSR標(biāo)記分析 在玉米幼苗期，剪取RIL群體及其親本葉片，采用SDS法[19]提取基因組DNA。在玉米10條染色體上選取430對SSR引物進(jìn)行親本間多態(tài)性篩選。公共引物序列均來自MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/），引物由上海生物工程公司（Sangon Company）合成。PCR反應(yīng)總體積為15 μl，包含：10×buffer（+MgCl2） 1.5 μl；dNTP（2.5 mmol/L） 1.2 μl；Taq酶（0.3 μl）；Forward primer（10 μmol/L） 0.4 μl；Reverse primer（10 μmol/L） 0.4 μl；DNA（20～50 ng/μl）2.0 μl；ddH2O 9.2 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸50 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，如長時間保存可放于-20 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物加入適量溴酚藍(lán)（擴(kuò)增產(chǎn)物和溴酚藍(lán)體積比為5 ∶1），混勻，在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳，銀染顯色，然后用Tanon Gis2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.5 數(shù)據(jù)記錄及分析 在Microsoft Excel上建立數(shù)據(jù)庫。對電泳帶型進(jìn)行基因型記錄，來源于母本80007的帶型記為A，父本80044的帶型記為B，此外極少數(shù)雜合帶型記為H，缺失帶型記為-。用SPSS13.0軟件對QTL定位群體2個環(huán)境下的調(diào)查結(jié)果進(jìn)行方差分析以及多態(tài)性標(biāo)記的卡平方檢驗(yàn)。根據(jù)SSR分析的結(jié)果，利用JoinMap Version 4.0（http：//joinmap.nl）作圖軟件，加密遺傳連鎖圖譜。應(yīng)用完備區(qū)間作圖（ICIM）軟件winQTLCart對表型值進(jìn)行QTL定位分析，LOD閾值設(shè)定為2.5，如果LOD值大于2.5則說明該LOD值對應(yīng)一個抗玉米粗縮病的QTL，以1 cm為步進(jìn)區(qū)間，進(jìn)行1 000次置換檢測。定位到的QTL位點(diǎn)，按照McCouch[20]等提出的規(guī)則進(jìn)行命名，即q+性狀名稱縮寫+染色體上序號。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米RIL群體對粗縮病的抗性表現(xiàn) 用玉米粗縮病的行發(fā)病率表示發(fā)病情況，參照路銀貴[18]等提出的等級標(biāo)準(zhǔn)，對2個環(huán)境下自然發(fā)病的群體進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果將濟(jì)寧環(huán)境下F9 ∶10株系劃分等級（圖1），而泰安環(huán)境下群體發(fā)病較輕，通過對調(diào)查數(shù)據(jù)的分析沒能在泰安檢測出抗病QTL。圖1表明，RIL群體的行發(fā)病率范圍變化幅度比較大，在30%～100%范圍內(nèi)呈連續(xù)性分布，整體趨向于感病親本。

2.2 分子標(biāo)記的檢測與SSR遺傳連鎖圖譜的加密 在實(shí)驗(yàn)室以前篩選的812對SSR引物的基礎(chǔ)上，增加了430對SSR引物，共1 242對引物在親本間進(jìn)行多態(tài)性檢測，結(jié)果共篩選出316對多態(tài)性引物，多態(tài)性比例為25.44%。在新增加的430對引物中挑選了96對擴(kuò)增條帶清晰、親本間條帶差異明顯的多態(tài)性引物進(jìn)行分析。前期試驗(yàn)構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜包含173個位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上試驗(yàn)加密了87個位點(diǎn)最終構(gòu)建了包含260個位點(diǎn)的遺傳連鎖圖譜，覆蓋玉米基因組1 170.00 cm，標(biāo)記間平均距離4.50 cm，標(biāo)記間最小遺傳距離為0.039 cm，每個連鎖群上的標(biāo)記數(shù)為17～40個，標(biāo)記在染色體上的順序與MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）的基本一致（表1和圖2）。

2.3 玉米粗縮病抗性QTL檢測 試驗(yàn)利用完備區(qū)間作圖法（ICIM）對濟(jì)寧環(huán)境下的粗縮病抗性QTL進(jìn)行定位分析，定位結(jié)果表明，在濟(jì)寧環(huán)境下檢測到1個QTL，位于2號染色體上，LOD值為4.48，解釋了9.57%的表型變異，其加性效應(yīng)為0.17，來自于抗病親本80007，與實(shí)驗(yàn)室以前定位到2號染色體上的QTLs結(jié)果相同，但沒有檢測出商偉定位到第1和5號染色體上的抗性QTLs（圖2）。

3 結(jié)論與討論

3.1 群體類型的選擇及表型鑒定問題 目前常用的遺傳作圖群體有BC 群體、 F2群體、DH 群體、RIL 群體、NIL 群體等。作圖群體的選擇主要取決于所使用標(biāo)記的類型，試驗(yàn)使用的SSR 標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，可用于在親緣關(guān)系較近的親本甚至一些近交獲得的群體中構(gòu)建遺傳圖譜[21]。RIL群體是將 F2個體連續(xù)自交或同胞交配、或群體內(nèi)隨機(jī)交配，使得雜種的基因得以分離并進(jìn)行重組，直至家系內(nèi)個體基因型純合穩(wěn)定、家系間基因型各異，此時這些家系就構(gòu)成了重組自交系群體。RIL群體作為固定的永久性群體，可以進(jìn)行多年多點(diǎn)的重復(fù)試驗(yàn)，是研究 QTL作圖、基因與環(huán)境互作的理想材料[22]。玉米粗縮病的田間自然發(fā)病條件難以控制，人工接種也不能確保發(fā)病的穩(wěn)定性，這為田間表型鑒定工作帶來很大的困難，利用永久性的RIL群體進(jìn)行表型鑒定能夠準(zhǔn)確判斷家系的抗性，提高定位的準(zhǔn)確性。

3.3 玉米粗縮病的抗性遺傳研究 玉米自交系間抗病性差異顯著，不同自交系抗病配合力也存在顯著差異。王安樂[23]等認(rèn)為玉米粗縮病抗性為數(shù)量性狀，多基因加性效應(yīng)在性狀表達(dá)中起主導(dǎo)作用。盡管自交系的基因趨于純合，但玉米抗粗縮病基因仍可處于雜合狀態(tài)，只是雜合程度不同而 已。隨著定向輪回選擇，個體中微效抗病基因量值逐步增多，基因的累加效應(yīng)也就增大，抗性也就隨之增強(qiáng)。王飛[24]對自交系90110、掖478及其F2群體、BC1群體進(jìn)行玉米粗縮病抗病性鑒定，最終找到了4個與玉米粗縮病抗病基因連鎖的分子標(biāo)記：umcl656（bin6.02）、umc1401（bin7.02）、bulg1823（bin8.07）和umcl268（bin8.07），推測在90110中至少存在3個玉米粗縮病抗病位點(diǎn)。陳永坤[9]以（黃早四×掖107）F8群體的179個家系為作圖群體，構(gòu)建連鎖圖譜，在山西臨汾環(huán)境下進(jìn)行抗病性鑒定及QTL定位分析，在染色體bin1.07、bin3.06和bin6.01區(qū)段檢測到3個QTL。同年，史利玉[13]等在山西臨汾和河北保定環(huán)境下對（黃早四×掖107）RIL群體進(jìn)行抗病鑒定，結(jié)果共檢測到4個抗病QTL，分別位于第1、2、5、9染色體上。陳永坤和史利玉在利用同一RIL群體且代數(shù)相同的情況下，檢測到的QTL卻不完全相同，可能與鑒定環(huán)境有關(guān)：陳永坤的鑒定結(jié)果是在2005年山西臨汾1個環(huán)境下得到的；史利玉的結(jié)果是綜合了山西臨汾和河北保定2地3個環(huán)境下（2005臨汾、2006臨汾及2006保定）得到的結(jié)果。張彥軍[16]等以一對近等基因系構(gòu)建的分離群體（NT409/NT411）F1為材料，在泰安5月份環(huán)境下檢測到的QTL位于標(biāo)記phi21～umc1817；在泰安6月份環(huán)境下檢測到的QTL位于標(biāo)記M6～M24。同一群體，在同一地點(diǎn)、不同時間檢測到的粗縮病抗性QTL不同。由于張彥軍采用的是田間自然感病的方法鑒定粗縮病，泰安5月份種植的群體苗期和泰安6月份種植的群體苗期分別與灰飛虱遷飛高峰期的重疊時間可能不同，導(dǎo)致鑒定結(jié)果有差異，檢測到不同的QTL。實(shí)驗(yàn)室前期[15]以（80007/80044）F5 ∶6為群體材料，在泰安和肥城環(huán)境下共檢測到8個QTL，分別位于第1、2、5號染色體，且泰安和肥城環(huán)境下檢測到的第2號染色體上的QTL均與標(biāo)記mmc0111連鎖。試驗(yàn)以（80007/80044）F9 ∶10的RIL群體為材料，在第1、5號染色體上均未檢測到QTL，但在濟(jì)寧環(huán)境下檢測到的位于第2號染色體的QTL也與標(biāo)記mmc0111連鎖，可能是同一個QTL。試驗(yàn)結(jié)果與前期結(jié)果存在差異可能是以下幾方面的原因：①遺傳連鎖圖譜的加密，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。試驗(yàn)構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜較商偉的圖譜在第1、5號染色體上分別增加了5、6個SSR標(biāo)記，在圖譜加密的情況下反而沒有檢測到QTL，因此推測第1、5號染色體上可能不存在粗縮病抗性QTL。②2群體代數(shù)的不同，前期試驗(yàn)的F5 ∶6群體雜合個體較多（理論上6.25%），試驗(yàn)的F9 ∶10群體基因型相對比較純合（雜合基因型理論上為0.0039%），群體材料的抗病位點(diǎn)也更加純合，定位結(jié)果應(yīng)該更加準(zhǔn)確。③鑒定環(huán)境的不同，前期的定位結(jié)果是在泰安和肥城環(huán)境下得到的，該試驗(yàn)結(jié)果是在濟(jì)寧環(huán)境下得到的，不同地點(diǎn)粗縮病發(fā)病情況不同，鑒定結(jié)果也不同。

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