摘要 [目的]構(gòu)建矮牽牛PhDFR基因的植物表達(dá)載體，并對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。[方法]從不同花色的矮牽牛中克隆了2個PhDFR基因，通過目的基因序列克隆、多步載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段，將其連入通用植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101繼而轉(zhuǎn)化煙草。[結(jié)果]構(gòu)建了含卡那霉素抗性篩選標(biāo)記基因NPTII和除草劑抗性篩選標(biāo)記基因Bar的GFP融合蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA2300PhDFRGFP和pCAMBIA3301PhDFRGFP。轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色結(jié)果進(jìn)一步驗證了所構(gòu)建表達(dá)載體的正確性和實(shí)用性。[結(jié)論]所構(gòu)建的表達(dá)載體為進(jìn)一步研究PhDFR基因在植物花色調(diào)控效應(yīng)的功能及開展植物花色改良基因工程研究奠定了基礎(chǔ)，為植物基因工程科研工作提供了優(yōu)良的備選植物表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞 DFR基因；植物表達(dá)載體；煙草遺傳轉(zhuǎn)化；Bar

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05380-05

Abstract [Objective] The aim was to construct a plant expression vector carrying Petunias PhDFR gene and to genetically transform it into tobacco. [Method] Two PhDFR gene was cloned from Petunia varieties with different flower color in the previous study. Through multi technical methods including sequence cloning of target genes， double enzyme digestion， plasmid vector connection and transformation， target gene PhDFR were introduced into the plant expression vector pCAMBIA2300 and pCAMBIA3301. These vectors were genetically transform into Agrobacterium tumefactions strain GV3101 and then applied in genetic transformation of tobacco recipient plants.

[Result] The plant overexpression vectors carrying target genes PhDFR， including pCAMBIA2300PhDFRGFP which contained kanamycin resistance selection marker gene NPTII and GFPfused gene， and pCAMBIA3301PhDFRGFP which contained Basta resistance marker gene Bar and GFPfused gene， were successfully constructed. The correctness and practicability of expression vector construct were further verified by GUS staining analysis of transgenic plants further. [Conclusion] The constructed plant overexpression vectors provide a foundation for further study on the function of PhDFR genes in regulating plant flower color and genetic engineering related to modification of plant flower color. This study also provided excellent alternative plant expression vectors for plant genetic engineering work.

Key words DFR gene； Plant expression vector； Tobacco genetic transformation； Bar

自然界中的花色素主要有3大類群：類黃酮類、類胡蘿卜素類和生物堿類[1]，而類黃酮類色素中的花色素苷（anthocyanin）是影響花色的主要色素，控制著花的粉紅色、紅色、紫羅蘭色和藍(lán)色[2]。植物花青素合成途徑已經(jīng)為人們所熟悉，類黃酮生物合成途徑中花色素苷形成如圖1所示。

花青素合成大致可以分為3個階段[3-6]，第1階段由苯丙氨酸到 4-香豆酰CoA，這是苯丙烷類次生代謝途徑所共有的；第2階段是類黃酮代謝的關(guān)鍵反應(yīng)，由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫堪非醇，該階段產(chǎn)生的黃烷酮和二氫堪非醇在不同酶作用下，可轉(zhuǎn)化為花青素和其他類黃酮物質(zhì)；第3階段由二氫黃酮醇到各種花青素的合成，其中有關(guān)的酶如類黃酮 3′羥化酶、類黃酮 3′，5′羥化酶、二氫黃酮醇還原酶，花青素合成酶ANS和類黃酮 3葡糖基轉(zhuǎn)移酶3GT，在這個過程中，花色素經(jīng)過各種甲基化、糖基化、羥基化等等反應(yīng)，最終形成了穩(wěn)定的花色素苷，各種不同的花色素苷的比例最終決定了植物的外觀顏色。

在花色素苷合成途徑中，從第2到第3階段的轉(zhuǎn)變中，由第2階段產(chǎn)生的黃烷酮和二氫堪非醇，可以在不同的酶作用下，或者進(jìn)入花青素合成途徑，或者合成其他類黃酮物質(zhì)，此過程中二氫黃酮醇還原酶（DFR）在花色素苷合成途徑中起著關(guān)鍵的作用，由DFR作用得到的產(chǎn)物，將作為后續(xù)合成花色素苷的底物，從而最終形成各種穩(wěn)定的花色素苷。DFR的氨基酸序列決定了其底物的種類，不同物種中 DFR 與底物的結(jié)合區(qū)域是高度保守的，其中第 134位氨基酸殘基直接決定底物的特異性[7]。由于不同物種的DFR 對底物選擇性不同，所以合成不同的花色素，呈現(xiàn)的花色各異[8]。

實(shí)驗室在前期研究中，從不同花色（紅色及藍(lán)色）矮牽牛（Petunia hybrid）品種材料中克隆到了2個序列有所差異的PhDFR基因，為了進(jìn)一步研究PhDFR基因在類黃酮/花色苷生物合成中的作用及不同DFR基因?qū)χ参锘ㄉ誀畹挠绊懀P者分別構(gòu)建卡那霉素及除草劑BASTA篩選標(biāo)記的PhDFR基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合的植物表達(dá)載體，對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，驗證其功能，以期為植物花色改良相關(guān)基因工程提供候選基因及備選植物表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。煙草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1）種子，為中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所植物資源化學(xué)研究室保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、 根癌農(nóng)桿菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株GV3101及植物表達(dá)載體pCAMBIA2300OCS、pCAMBIA3301OCS，均為實(shí)驗室保存；含有外源基因FT與綠色熒光蛋白GFP融合的雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA2300FTGFP，由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師贈與。克隆載體TVector pMD19 Simple，購自大連寶生物公司；目的基因PhDFR2（克隆自紅色矮牽牛品種，GenBank登錄號：KC46484）及PhDFR3（克隆自藍(lán)色矮牽牛品種，GenBank登錄號：KC464485）保存于克隆載體pGEMPhDFR2和pGEMPhDFR3中。

1.1.3 主要試劑。PCR所用的酶Es Taq DNA Polymerase及buffer，購自康為世紀(jì)；連接酶T4 DNA Ligase、Xgal、IPTG、λDNA /EcoRI+Hind Ⅲ Marker和DL2000Marker，購自寶生物（大連）公司；限制性內(nèi)切酶選用Thermo Scientific Fast Digest，購自美國Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；測序及引物合成，均委托上海生工生化試劑有限公司；BAR基因篩選劑Basta（活性成分為草丁膦PPT，Phosphinothricin）、氨芐青霉素（Ampicillin）及卡那霉素（kanamycin），購自Sigma公司；6芐基腺嘌呤（6BA）、吲哚乙酸（IAA）以及細(xì)菌培養(yǎng)基為進(jìn)口分裝，其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 目的基因序列的克隆。利用實(shí)驗室已經(jīng)保存的PGEMPhDFR2和PGEMPhDFR3載體為模板（已測序），因為2個DFR基因的編碼區(qū)兩側(cè)堿基序列完全一致，設(shè)計帶KpnIXbalI酶切位點(diǎn)的引物PhDFRF： GGTACC ATGGCAAGTGAAGCAGTTC和PhDFRR： TCTAGAG ACTTCAACATTGCTTAACATT，用PCR制備帶有酶切位點(diǎn)目的基因編碼區(qū)的插入片段，選用20 μl的PCR體系，包括10×PCR buffer 2 μl，dNTPs （10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，Es taq DNA Polymerase（5 U/μl）0.2 μl，模板質(zhì)粒0.5 μl，ddH2O 14.8 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，75 s；35個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠（1.0%）中電泳檢測并回收，并連接到TVector PMD19 simple載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白斑，使用菌落PCR驗證后送公司進(jìn)行測序，含有目的基因的新載體命名為 pMD19PhDFR2和pMD19PhDFR3。

1.2.2 表達(dá)載體pCAMBIA2300PhDFR2GFP和pCAMBIA2300PhDFR3GFP的構(gòu)建。用Kpn1Xbal1酶切體系對pMD19PhDFR2、pMD19PhDFR3、pCAMBIA2300FTGFP載體進(jìn)行雙酶切，然后電泳、回收目的基因片段及載體骨架片段，用T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素篩選陽性克隆，使用菌落PCR和質(zhì)粒酶切驗證確定正確的重組子，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA2300PhDFR2GFP和pCAMBIA2300PhDFR3GFP。

1.2.3 表達(dá)載體pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301PhDFR3GFP的構(gòu)建。對pCAMBIA3301 OCS和2300PhDFR3GFP進(jìn)行EcoRIPstI雙酶切，電泳并回收pCAMBIA3301骨架部分及PhDFR3載體小片段（含目的基因表達(dá)盒），連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素篩選陽性克隆，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA3301PhDFR3GFP。

對已經(jīng)構(gòu)建好的pCAMBIA3301PhDFR3GFP和pCAMBIA2300PhDFR2GFP進(jìn)行EcoRIXbaI的雙酶切，電泳并回收pCAMBIA3301PhDFR3GFP大片段及PhDFR2載體小片段，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA3301PhDFR2GFP。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。利用凍融法將重組質(zhì)粒pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301 PhDFR3GFP轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株GV3101[9]，陽性克隆經(jīng)過PCR驗證后長期保存。

1.2.5 表達(dá)載體對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定。煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株中報告基因GUS的分析檢測，參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。不定芽誘導(dǎo)和選擇培養(yǎng)基為 MS基本培養(yǎng)基附加2 mg/L 6BA+0.1 mg/L NAA+10 mg/L Basta+400 mg/L羧芐青霉素+3%蔗糖+7 g/L瓊脂。生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加15 mg/L Basta+400 mg/L羧芐青霉素+3%蔗糖+7 g/L瓊脂。GUS基因檢測，分別從具有Basta抗性的完整再生植株和野生型煙草植株上（陰性對照）取下葉片切割成約0.5 cm×0.5 cm大小，置于裝有GUS（含XGluc）染液的離心管中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，然后用95%乙醇脫色（除去葉綠素）直至陰性對照材料為無色為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因序列的克隆 利用帶Kpn1Xbal酶切位點(diǎn)的引物，從實(shí)驗室保存的PGEMPhDFR2和PGEMPhDFR3載體PCR擴(kuò)增處帶有酶切位點(diǎn)的PhDFR2和PhDFR3目的基因片段（圖2A），電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小接近1 200 bp，與預(yù)期一致。插入片段經(jīng)凝膠回收，連接至PMD19T載體，雙向測序及雙酶切驗證結(jié)果表明轉(zhuǎn)化、連接正確，克隆載體pMD19PhDFR2和pMD19PhDFR3構(gòu)建成功。

2.3 表達(dá)載體pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301PhDFR3GFP的構(gòu)建及其驗證 含有Bar基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建利用本實(shí)驗室已構(gòu)建保存的pCAMBIA3301OCS進(jìn)行。首先，將pCAMBIA2300PhDFR3GFP進(jìn)行EcoR1PstI雙酶切，然后回收小片段的PhDFR3目的基因表達(dá)盒以及pCAMBIA3301的骨架部分，連接轉(zhuǎn)化后，用雙酶切方法對重組子進(jìn)行驗證，結(jié)果與預(yù)期相符，證明已經(jīng)成功地將PhDFR3基因表達(dá)盒引入pCAMBIA3301載體，成功構(gòu)建了含有BAR、pDFR3GFP的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301PhDFR3GFP（圖5B）。

由于PhDFR2基因內(nèi)部含有Pst1位點(diǎn)，不能直接使用EcoRIPstI雙酶切的方法構(gòu)建Bar基因表達(dá)載體，因此利用EcoRIXbaI雙酶切將pCAMBIA2300PhDFR2GFP中的PhDFR2目的基因片段引入pCAMBIA3301PhDFR3GFP，成功構(gòu)建了pCAMBIA3301PhDFR2GFP植物表達(dá)載體（圖5A）。

2.4 煙草轉(zhuǎn)基因植株的獲得及GUS檢測 將構(gòu)建成功的pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301 PhDFR3GFP重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，PCR驗證后，進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過篩選獲得了具有Basta抗性的再生植株（圖6）。對于Basta篩選條件下生根良好、葉色及形態(tài)正常的再生植株進(jìn)行GUS染色。結(jié)果顯示，野生型葉片呈現(xiàn)白色，無本底水平的GUS活性，推測的轉(zhuǎn)基因植株的葉片，經(jīng)過GUS染色、酒精洗脫，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色結(jié)果。結(jié)果表明，表達(dá)載體中的TDNA區(qū)整合到了煙草基因組中，同時所帶篩選標(biāo)記基因GUS正常表達(dá)，表達(dá)載體構(gòu)建正確。對目的基因及GFP報告基因的表達(dá)檢測以及功能分析正在進(jìn)一步試驗研究中。

3 結(jié)論與討論

花色素苷是影響植物花色的主要色素之一，其生物合成途徑屬于苯丙烷類次生代謝途徑中的類黃酮合成途徑，類黃酮類化合物是植物花青素的主要成分，是花卉、果實(shí)、種皮重要的成色物質(zhì)。DFR是類黃酮/花青素生物合成途徑的一個關(guān)鍵酶，在類黃酮途徑中，DFR催化二氫黃酮醇，如二氫堪非醇 （dihydrokaempferol， DHK）、二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM）），分別生成無色天竺葵素、無色矢車菊素和無色飛燕草素（翠雀素），最后在各種修飾酶的作用下形成穩(wěn)定的花色苷類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，來自不同物種的DFR結(jié)合底物的特異性有所不同，對不同底物催化活性也不相同，因而植物中DFR的結(jié)構(gòu)及催化活性對形成不同花色具有決定性的作用。矮牽?；ㄉS富，是非常重要的園藝花卉植物，因其植株再生容易，遺傳背景清楚，因此也是研究植物花色的模式植物之一。試驗利用不同花色（紅色及藍(lán)色）矮牽牛品種中克隆獲得的PhDFR基因，構(gòu)建不同篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體，為了進(jìn)一步研究這2個DFR基因的功能及對植物花色性狀的影響提供了良好的前期基礎(chǔ)，同時也為植物花色改良相關(guān)基因工程提供候選基因及備選植物表達(dá)載體。

目前植物基因工程商業(yè)化應(yīng)用最廣泛、效果最好的就是除草劑抗性基因和抗蟲基因。除草劑抗性基因中研究應(yīng)用較多的是Bar基因，其表達(dá)產(chǎn)物可以提供對草丁膦（PPT）類除草劑的抗性，因此抗除草劑基因既可作為目的基因，又可作為篩選標(biāo)記基因。試驗分別重組構(gòu)建了PhDFR基因的pCAMBIA2300系列和pCAMBIA 3301系列的2類植物表達(dá)載，分別可以用于篩選劑卡那霉素和除草劑Basta（PPT）的植物遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過酶切鑒定以及轉(zhuǎn)基因植株GUS染色，基本可以確定植物表達(dá)載體構(gòu)建正確。

在構(gòu)建載體的過程中，不僅要了解清楚載體上已有的酶切位點(diǎn)，還要注意目的基因片段內(nèi)部是否有和載體上相同的酶切位點(diǎn)，這對于酶切連接至關(guān)重要。在試驗中，在PhDFR基因上游起始密碼子處設(shè)計了帶有酶切位點(diǎn)KpnI的引物，在下游終止密碼子處設(shè)計了帶有XbalI的引物，便于將目的基因引入實(shí)驗室保存的pCAMBIA2300FTGFP載體，形成35S啟動子控制的PhDFRGFP的融合基因表達(dá)盒。pCAMBIA2300系列載體是含有Km篩選標(biāo)記的常用植物表達(dá)載體，然而考慮到最終抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生產(chǎn)應(yīng)用優(yōu)勢，又將pCAMBIA2300PhDFRGFP中PhDFRGFP所在的表達(dá)框用EcoRIPstI雙酶切，插入到表達(dá)載體pCAMBIA3301OCS中相應(yīng)的位點(diǎn)，獲得了含有目的基因PhDFR融合GFP的pCAMBIA3301系列表達(dá)載體。最終構(gòu)建的pCAMBIA3301PhDFRGFP含有報告基因GUS、GFP以及除草劑抗性基因Bar的植物表達(dá)載體。其中GUS篩選基因編碼的β葡萄糖苷酸酶，能夠?qū)⒆饔玫孜?溴4氯3吲哚葡萄糖苷酸（XGluc）轉(zhuǎn)化形成不溶解的深色的靛藍(lán)色物質(zhì)，使得表達(dá)GUS基因的部位呈現(xiàn)藍(lán)色。此外，GUS基因可以作物融合蛋白，可以定量分析，有方便快捷的特點(diǎn)。因此，GUS基因成為目前廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛械闹匾獔蟾鏄?biāo)記。有人認(rèn)為田間卡那霉素檢測結(jié)合室內(nèi)GUS檢測同時進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后代的純合選育是一個切實(shí)可行的方法[11]。由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，為使底物更好進(jìn)入細(xì)胞，可采用抽真空促進(jìn)滲透的辦法，如果不抽真空，在植物葉片上藍(lán)色沉淀就會少一些，有時候甚至檢測不出來[12]。融合基因GFP具有優(yōu)異的報告基因的特點(diǎn)[13]：無需底物或輔助因子，容易檢測，反應(yīng)靈敏；植物本身不含GFP，不受假陽性干擾；熒光性質(zhì)穩(wěn)定，便于觀察；對轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞無毒害，可借助熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞非損傷性篩選；基因編碼序列短，構(gòu)建載體方便，構(gòu)建融合蛋白優(yōu)勢明顯；廣譜性，可用于不同屬種的動植物及微生物。因此結(jié)合GFP可以對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行進(jìn)一步檢測，可以避免GUS染色出現(xiàn)假陰性，同時也進(jìn)一步提高了試驗的準(zhǔn)確性，豐富了檢測的方法，使實(shí)驗結(jié)果驗證更加充分可靠。

試驗同時構(gòu)建了卡那霉素及Bar篩選標(biāo)記基因的PhDFR植物表達(dá)載體，可用于適合不同篩選劑的植物遺傳轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步研究該基因在植物花色調(diào)控效應(yīng)的功能及開展植物花色改良基因工程研究奠定了基礎(chǔ)；同時所構(gòu)建的pCAMBIA3301系列表達(dá)載體為植物基因工程科研工作提供了優(yōu)良的備選植物表達(dá)載體，其不僅可以通過 GUS 染色對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行快速鑒定，而且還融合了GFP報告基因，使目的基因的精確組織表達(dá)定位成為可能，載體上豐富的酶切位點(diǎn)也適合于其他基因超表達(dá)載體的構(gòu)建。

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