摘要

[目的]探討干酪乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特征。[方法]對(duì)干酪乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素分別進(jìn)行抑菌活性、熱敏感性、pH范圍、蛋白酶敏感性、表面活性劑分析。首先排除過(guò)氧化氫、有機(jī)酸的干擾，采用牛津杯雙層平板法，檢測(cè)無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的抑菌活性。[結(jié)果]細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌具有明顯的抑制作用;在pH 3.0～5.5穩(wěn)定性較好;具有良好的熱穩(wěn)定性;經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后細(xì)菌素失活，表明抑菌成分為蛋白類物質(zhì);加入EDTA，抑菌活性明顯增強(qiáng)。[結(jié)論]干酪乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素是具有良好的熱、酸穩(wěn)定性和較廣抗菌譜的蛋白類物質(zhì)，可為其在防腐保鮮等領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 "干酪乳桿菌;抑菌活性;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S188 "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A "文章編號(hào) 0517-6611（2014）32-11542-02

Analysis of Biological Characteristics of Bacteriocin Produced by Lactobacillus casei

YU Wei1， GAO Xuejun2， MA Chunli2， ZOU Li1* et al

（1.College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040; 2. Key Lab of Dariy Science，Ministry of Education， Northeast Agricultural University， Harbin， Heilongjiang 150030）

Abstract [Objective] To discuss the biological characteristics of bacteriocin produced by Lactobacillus casei. " "[Method] The antibacterial activity， thermal sensitivity， pH range， proteases sensitivity and surfactants of bacteriocin produced by Lactobacillus casei was analyzed. Firstly exclude the interference from organic acid and hydrogen peroxide， then oxford plate doublelayer agar method was used to test the antimicrobial activity of cellfree fermentation supernatant. [Result] The results showed that bacteriocin had potent inhibitory effects on Staphylococcus aureus， Salmonella serovars，Escherichia coli and Listeria monocytogenes; it had good stability between the pH value 3.0 to 5.0; and it also had good stability against heat; Bacteriocin was inactive after treatment with trypsin， pepsin， indicating that the antibacterial component were protein; when EDTA was added， the antibacterial activity became significantly stronger. [Conclusion] The bacteriocin produced by L.casei was an antimicrobial protein with good thermal stability， acid stability and a broad antibacterial spectrum， the study can provide scientific basis for further application of it in preservation.

Key words "Lactobacillus casei; Antibacterial activity; Biological characteristics

細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)復(fù)合物，對(duì)同種或近緣的菌種具有抑制作用[1-2]。乳酸菌是食品安全級(jí)微生物（GRAS），在生長(zhǎng)過(guò)程中具有產(chǎn)細(xì)菌素的能力[3]，因此乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素作為天然防腐劑已成為研究熱點(diǎn)而備受關(guān)注[4-5]，但大多數(shù)乳酸菌所產(chǎn)的細(xì)菌素抑菌譜較窄、熱不穩(wěn)定、pH范圍較窄[6]，商業(yè)化應(yīng)用的只有Nisin和pediocinPA等少數(shù)幾種乳酸菌細(xì)菌素[7]。

干酪乳桿菌作為益生菌的一種，具有降膽固醇、緩解乳糖不耐癥、增強(qiáng)人體免疫及預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長(zhǎng)等益生保健作用[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素具有廣譜性，屬于Class IIb類細(xì)菌素，通常需要兩個(gè)肽鏈的共同作用發(fā)揮抑菌活性[9]。筆者從抑菌活性、熱穩(wěn)定性、pH范圍、蛋白酶敏感性、表面活性劑等方面探討干酪乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素的生物特性，旨在為該細(xì)菌素將來(lái)在防腐保鮮等領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 "材料與方法

1.1 " 材料

1.1.1

菌株。產(chǎn)細(xì)菌素菌株：干酪乳桿菌，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心提供。

1.1.2

指示菌。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、沙門氏菌（Salmonella）ATCC14028、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）NICPBP54002，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.3

儀器與設(shè)備。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DH1013BS，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;精密電子天平，瑞士梅特勒-托利多;高壓滅菌鍋HVE50，日本HIRAYAMA;梅特勒-托利多Delta320pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多;電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP9272，上海一恒科技有限公司;各種規(guī)格移液槍，芬蘭雷勃公司;牛津杯，哈爾濱賽拓公司。

1.2 "方法

1.2.1

菌株活化。菌株于-80 ℃冷凍保存，使用前將干酪乳桿菌菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，菌液在固體培養(yǎng)基中三區(qū)劃線，活化傳代2次以上，用接種環(huán)挑平板中長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行鏡檢。指示菌接種于LB培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)[10]。

1.2.2

無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備。干酪乳桿菌的發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min，4 ℃離心15 min，用6 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，中和有機(jī)酸的干擾。過(guò)氧化氫酶加入到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液中，使過(guò)氧化氫酶的終濃度為5.0 mg/ml，37 ℃水浴2 h后取出，排除過(guò)氧化氫酶的干擾。上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾去除菌體及雜質(zhì)，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3

細(xì)菌素抑菌活性的測(cè)定。采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[11]檢測(cè)細(xì)菌素的抑菌活性。在無(wú)菌狀態(tài)下，將指示菌懸濁液均勻涂在LB平板上，培養(yǎng)皿于操作臺(tái)內(nèi)干燥30 min，待菌液完全吸收。每個(gè)平板內(nèi)均勻放入4個(gè)內(nèi)徑為6 mm牛津杯，下壓使其無(wú)間隙，將200 μl乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液滴入牛津杯孔內(nèi)，平板在指示菌的最適溫度下過(guò)夜培養(yǎng)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量平板上抑菌圈的大小[12]，每組設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次試驗(yàn)，確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.2.4

pH對(duì)抑菌活性的影響。取1 ml無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，分別用1 mol/L的NaCl和NaOH將pH調(diào)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.2.5

溫度對(duì)抑菌活性的影響。取1 ml無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，分別于37、60、80、100、121 ℃處理15 min，測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.2.6

蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響。取1 ml無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，將pH調(diào)至各種酶的最適pH條件下，按照1.0 "mg/ml的濃度分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和α淀粉酶，在各自適宜的溫度下處理2 h使酶失活，檢測(cè)抑菌活性的變化情況。

1.2.7

表面活性劑對(duì)抑菌活性的影響。取1 ml無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，分別加入吐溫20、吐溫80、SDS、尿素、Triton X100、EDTA，使各物質(zhì)的終濃度為1 mg/ml，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，未加表面活性劑的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液為對(duì)照。

2 "結(jié)果與分析

2.1 " 細(xì)菌素的抑菌活性分析

由圖1可知，干酪乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌4種致病菌均有明顯的抑制作用，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的抑制作用明顯大于對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑可達(dá)到18.0 mm左右，對(duì)單核增生李斯特菌抑菌圈直徑為17.6

mm，對(duì)革蘭氏陰性菌沙門氏菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為

16.0、15.5 mm。以上抑菌效果表明，干酪乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素可以抑制部分革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌的生長(zhǎng)，是一種廣譜型抑菌物質(zhì)。

注：1.大腸桿菌;2.李斯特菌;3.沙門氏菌;4.金黃色葡萄球菌。

圖1 "無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液對(duì)幾種菌的抑菌效果

2.2 "pH對(duì)抑菌活性的影響

由表1可知，干酪乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素在pH為3.0～5.5有明顯的抑菌效果，當(dāng)pH=4.0時(shí)抑菌效果最明顯，可推測(cè)其為最適pH，當(dāng)pHgt;4.0時(shí)，隨著pH的增加抑菌圈直徑逐漸減小，抑菌活性降低，當(dāng)pH=6.0時(shí)，細(xì)菌素的抑菌效果消失。由此可見(jiàn)，干酪乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素在酸性條件下保持穩(wěn)定狀態(tài)，且具有較高的抑菌活性，這與許多乳酸菌細(xì)菌素特性相似。

表1 "pH對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響

樣品抑菌圈直徑∥mm

pH 3.0pH 3.5pH 4.0pH 4.5pH 5.0pH 5.5pH 6.0

發(fā)酵上清液16.0±0.1816.25±0.1116.5±0.1515.80±0.2514.75±0.2114.05±0.12-

無(wú)菌水10.85±0.2210.06±0.12-----

注：表中“-”表示無(wú)抑菌作用。

2.3 "溫度對(duì)抑菌活性的影響

經(jīng)不同溫度處理無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液20 min后，如圖2所示，隨溫度的升高，抑菌活性呈逐漸下降的趨勢(shì)，這可能是高溫影響細(xì)菌素的分子結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)菌素抑菌活性降低。在37～100 ℃范圍內(nèi)，抑菌圈直徑均能達(dá)到15.00 mm以上，保持很高的抑菌活性，但是經(jīng)121 ℃處理后，抑菌圈直徑明顯小于以上不同溫度處理的結(jié)果，抑菌效果降低，但仍保持80%的抑菌活性。由此可見(jiàn)，干酪乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖2 "溫度對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響

2.4 "蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響

通常細(xì)菌素由于自身的蛋白質(zhì)特性對(duì)一些蛋白酶敏感，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等，在部分蛋白酶作用后，抑菌活性降低或完全失去活性。由表2可知，經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后該細(xì)菌素抑菌活性分別降低了34.0%、33.0%，失去抑菌活性，經(jīng)木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后該細(xì)菌素的抑菌效果無(wú)明顯影響，經(jīng)α淀粉酶處理后抑菌活性下降16.0%，說(shuō)明該細(xì)菌素是一種蛋白類物質(zhì)，對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感，作為食品防腐劑可被人體降解，不會(huì)引起不良反應(yīng)。

2.5 表面活性劑對(duì)抑菌活性的影響

由表3可知，經(jīng)吐溫20、吐溫80、尿素和Triton X100處理后，對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌抑制作用無(wú)顯著性變化（Pgt;0.05），但是加入SDS作