摘要

[目的]比較4種測定細胞凋亡方法的優(yōu)缺點。[方法]應(yīng)用流式細胞儀，分別采用PI單染法、Annexin VFITC/ PI 復染法、羅丹明123染色法及Fluo3染色法測定細胞凋亡。[結(jié)果]每種分析方法均有自己優(yōu)勢和不足，在檢測過程中應(yīng)進行多參數(shù)分析。[結(jié)論]該研究可為后續(xù)研究提供試驗方法支持。

關(guān)鍵詞 流式細胞儀;細胞凋亡;檢測方法

中圖分類號 S1088;G306.0 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11240-03

Comparison of Four Methods for Apoptosis Assay by Flow Cytometry

FAN Ningjuan1， XIANG Ping2*， DUAN Min1

（1.College of Life Sciences， Northwest Aamp;F University，Yangling， Shaanxi 712100; 2. College of Plant Protection， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract [Objective]The research aimed compare the advantages and disadvantages of four methods for apoptosis assay. [Method] Flow cytometry was used to examine cell apoptosis which labeled with PI， Annexin VFITC/PI， Rhodamine 123 and Fluo3 respectively. [Result] Each menthod had its merits and drawbacks， and multiparameter analysis should be considered in the inspection process. [Conclusion]It could provide experimental support for sequential studies.

Key words "Flow cytometry; Apoptosis; Detection method

1972年，Kerr等[1]首次提出細胞凋亡（Apoptosis， APO）的概念，宣告對細胞凋亡探索的真正開始。細胞凋亡是細胞在多重因素參與調(diào)控下正常的、自動死亡的生理過程。它不同于一般意義上的細胞壞死。異常凋亡狀態(tài)的出現(xiàn)會導致多種疾病的發(fā)生[2-4]。因此，細胞凋亡的檢測在生物學研究中備受關(guān)注。

流式細胞儀（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀70年代發(fā)展起來的高科技產(chǎn)品[5-7]，在檢測細胞凋亡方面具有簡單、快速和敏感性高的特點，是研究細胞凋亡的主要手段[8-9]。筆者使用PARTEC 流式細胞儀，通過比較PI單染法、Annexin VFITC/ PI復染法、羅丹明123染色法及Fluo3染色法4種測定細胞凋亡的方法，分析優(yōu)缺點，以期為后續(xù)研究提供理論和試驗支持。

1 "材料與方法

1.1 "試驗材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）購自武漢細胞庫，脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）購自sigma 公司，細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、Annexin VFITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、羅丹明123膜電位檢測試劑盒、Fluo3鈣離子濃度檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細胞收集方法

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）在DMEM/F12培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清、100 μg/L青霉素、100 μg/L鏈霉素）中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用1.25 g/L胰酶消化傳代。收集對數(shù)生長期HUVEC細胞，配成2×106個/ml單細胞懸液，加入LPS（濃度為20 mg/L）誘導細胞凋亡，以未經(jīng)處理的HUVEC細胞作為陰性對照。

1.3 細胞凋亡檢測方法

參照不同的檢測試劑盒說明書對細胞進行染色，用德國PARTEC公司生產(chǎn)的Cube 8型流式細胞儀檢測，每次計數(shù)2萬個細胞。PI法檢測的亞“G1”峰用ModFit LT 4.0軟件分析，其余結(jié)果用軟件FCS express 4.0分析。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "PI法檢測亞“G1”峰

處于增殖周期中的細胞，其DNA含量分布于2n～4n之間。發(fā)生凋亡的細胞由于細胞核內(nèi)的DNA裂解成許多小片段，經(jīng)乙醇固定后由于乙醇能迅速溶解細胞膜中的脂質(zhì)，繼而在細胞膜上形成小孔，導致小分子量的DNA片段穿過細胞膜進入乙醇溶液中造成流失，僅剩下大片段的DNA，最終導致凋亡細胞內(nèi)DNA含量減少。經(jīng)DNA熒光染料碘化丙啶（PI）染色后熒光強度明顯減小，形成一個DNA含量小于2n（即G1期細胞）的分布區(qū)，稱為亞“G1”峰。根據(jù)此峰，可測出凋亡細胞的百分率[10]。從圖1可以看出，在陰性對照的DNA直方圖上，G1峰前只出現(xiàn)一個連續(xù)的DNA小片段分布曲線（含量僅為1.6%），而經(jīng)誘導凋亡處理后的陽性對照在相同位置出現(xiàn)一個呈高斯分布的亞“G1”峰，由此可以認定凋亡已發(fā)生（凋亡百分比為10.2%）。

PI檢測法操作簡便、快速，試驗費用較低，但是測定結(jié)果的敏感性不明顯。原因主要有兩點：①早期凋亡細胞尚未出現(xiàn)DNA片段的大量流失，此時細胞的DNA不會出現(xiàn)在凋亡峰中，即不能區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞;②不能準確檢出S期和G2細胞的凋亡，因為S期和G2細胞凋亡的峰形可能與G1期或S期區(qū)域發(fā)生重疊，需借助其他方法進行檢測。

2.2 "Annexin VFITC/ PI 復染法檢測細胞凋亡

膜聯(lián)蛋白Annexin V能與磷脂酰絲氨酸（簡稱PS）發(fā)生特異性結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸熒光染料。它不能透過正常細胞膜，只能進入已破損的細胞膜。在細胞發(fā)生早期凋亡時，其細胞膜發(fā)生重排，繼而使PS發(fā)生翻轉(zhuǎn)暴露于細胞膜外。由于此時細胞膜仍保持完整，只能與熒光素FITC標記的Annexin V結(jié)合，而不能結(jié)合PI（即FITC+/PI-）;晚期凋亡細胞和壞死細胞則因為細胞膜的通透性發(fā)生改變，同時能被Annexin V和PI標記，呈現(xiàn)出雙陽性（FITC+/PI+）;正常細胞因為胞膜完整且沒有PS翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象而表現(xiàn)為雙陰性（即FITC-/PI-）。因此，可通過Annexin VFITC/ PI復染法將凋亡早晚期的細胞區(qū)分開來[11]。圖2是Annexin VFITC/PI 復染法檢測細胞凋亡結(jié)果?？梢钥闯觯幮詫φ罩袔缀鯖]有凋亡發(fā)生，而經(jīng)凋亡誘導處理后早期凋亡細胞（右下象限，6.76%）、晚期凋亡和壞死細胞（右上象限，5.61%）的含量均明顯增加。

圖1 " PI單染法亞“G1”峰檢測法測定結(jié)果

圖2 "Annexin VFITC/ PI 復染法檢測細胞凋亡結(jié)果

Annexin VFITC/ PI 復染法的主要特點是細胞分群比較明顯，檢測結(jié)果的靈敏性和準確性顯著提高，但有一定的局限性。主要表現(xiàn)為：①檢測試劑盒比較昂貴，提高了研究成本;②不能將晚期凋亡細胞和壞死細胞區(qū)分開，因此檢測過程必須使用活細胞;③樣本制備過程較嚴格，一方面不能破壞細胞膜的完整性，另外染色過程中需盡量增加早期凋亡細胞比例，以保證測定結(jié)果真實、可靠。

2.3 "羅丹明123染色法檢測細胞凋亡

正常細胞的細胞膜內(nèi)外維持著不同離子的濃度梯度，包括Na+、K+、Cl-、Ca2+等，從而形成細胞膜電位，而線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。羅丹明123是一種親脂性陽離子熒光染料，也是一種膜電位指示劑。它能夠依賴膜電位順利地穿透活細胞的細胞膜和線粒體膜而富集于線粒體，發(fā)出強綠色熒光。當細胞發(fā)生凋亡時，線粒體膜的轉(zhuǎn)運能力下降，電負性降低，其積聚羅丹明123的能力削弱，造成平均熒光強度下降[12]。圖3是羅丹明123染色法檢測結(jié)果?？梢钥闯?，與陰性對照相比，經(jīng)凋亡誘導處理后的細胞內(nèi)羅丹明123平均熒光強度（mean：291.64）比陰性對照（mean：327.81）要弱，峰形左移，表明線粒體膜電位下降，細胞發(fā)生凋亡。

羅丹明123染料對線粒體有極強的親和力，因此這種方法檢測的靈敏性較高。但是，由于早期凋亡細胞的細胞膜和活細胞相比還是比較完整的，擁有大多數(shù)的細胞功能，故不能引起膜電位的下降，而羅丹明123法不能將早期凋亡細胞和活細胞鑒別開來。

2.4 "Fluo3染色法檢測鈣離子濃度

人體內(nèi)的鈣離子（Ca2+）濃度的變化對細胞凋亡起重要作用[13]。細胞凋亡與細胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)，刺激信號通過復雜的信息傳遞途徑引起Ca2+濃度的變化。細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，會激活核酸內(nèi)切酶，進一步將DNA降解為180～200 bp或其倍數(shù)的片段， 從而觸發(fā)細胞凋亡[14]。Fluo3是鈣離子熒光探針之一。它可以在乙酰甲酯（簡稱Am）協(xié)助下通過細胞膜進入細胞內(nèi)，與細胞內(nèi)的游離Ca2+結(jié)合，發(fā)出強于Fluo3本身40倍以上強度的熒光，且此時的熒光強度和游離鈣離子的濃度呈正比。圖4是Fluo3染色法檢測鈣離子濃度的測定結(jié)果。與陰性對照相比，經(jīng)凋亡誘導處理后的細胞內(nèi)Fluo3平均熒光強度（mean：42.55）明顯高于陰性對照（mean：31.53），峰形右偏，表明細胞內(nèi)鈣離子的濃度增加。這也意味著細胞發(fā)生凋亡。

圖3 羅丹明123染色法檢測結(jié)果

圖4 Fluo3染色法檢測鈣離子濃度測定結(jié)果

Fluo3染料與游離Ca2+結(jié)合后的熒光強度極強，因而避免Fluo3染料自發(fā)熒光的干擾，適合測定細胞內(nèi)Ca2+快速、微量的變化，但它同樣不能有效地將早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞區(qū)分開。

3 結(jié)語

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細胞儀已成為檢測細胞凋亡的重要手段。除上述4種方法外，Tunel法、吖啶橙染色法等也可用于細胞凋亡的檢測，但在試驗操作中還未對這些方法進行嘗試。由于在選擇方法前還需考慮細胞樣品性質(zhì)、凋亡誘導劑特性、所需要獲得的信息及技術(shù)限制等，采用流式細胞儀對凋亡細胞的單一特征測定通常不足以判定細胞亡，應(yīng)進行多參數(shù)分析或結(jié)合形態(tài)學的評價才更為準確。

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