摘要 從二色補(bǔ)血草（Limonium bicolor）cDNA文庫中分離出一個(gè)生長(zhǎng)素抑制蛋白基因LbARP（GenBank登錄號(hào)為KF886022）。該基因全長(zhǎng)698 bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，開放讀碼框（ORF）387 bp，共編碼128個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)分子量為13.84 kDa，理論等電點(diǎn)為9.69。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與其他植物的ARP蛋白序列相似性達(dá)到50%以上，具有生長(zhǎng)素抑制基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR結(jié)果表明，LbARP基因能夠?qū)aCl、ABA、CuSO4、CdCl2及ZnCl2等非生物脅迫作出應(yīng)答。

關(guān)鍵詞 二色補(bǔ)血草;生長(zhǎng)素抑制蛋白;實(shí)時(shí)定量PCR

中圖分類號(hào) S567 "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A "文章編號(hào) 0517-6611（2014）32-11250-03

Cloning and Expression of an Auxinrepressed Protein Gene LbARP from Limonium bicolor

DIAO Guiping， LIU Yan， SONG Jia， LIU Zhihua et al "（Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract The full length cDNA of a novel auxin repressed protein （LbARP） gene was cloned from a cDNA library of Limonium bicolor （GenBank accession No. KF886022 ）. The fulllength cDNA sequence of LbARP is 698 bp， including three exons and two introns. The open reading frame （ORF） is 387 bp in length， encoding a deduced amino acid sequence of 128 residues with a molecular weight of 13.84 kDa and an isoelectric point of 9.69. Sequence alignment of the deduced amino acids of LbARP revealed a low degree of similarity with other members of plant ARP and had a typical domain characteristic. The results of realtime quantitative PCR showed that LbARP can response to the treatments of NaCl， ABA， CuSO4， CdCl2 and ZnCl2.

Key words Limonium bicolor; Auxinrepressed protein; Real time RTPCR

生長(zhǎng)素作為一類重要的信號(hào)分子，通過調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。以往克隆的生長(zhǎng)素相關(guān)基因多以誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)橹?，而誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)的基因很少，生長(zhǎng)素抑制蛋白（auxin repressed protein， ARP）基因是其中重要的一類[1]。目前，ARP基因已從豌豆、刺槐、煙草和辣椒等[2-4]植物中克隆出來，但在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中所起的作用還知之甚少[5]，在國內(nèi)更是很少被研究。筆者從耐鹽堿植物二色補(bǔ)血草中克隆到一個(gè)新的LbARP基因，對(duì)該基因的序列進(jìn)行了分析，并用實(shí)時(shí)定量RTPCR分析了該基因在NaCl、CdCl2、CuSO4、ZnCl2和ABA 5種脅迫下不同時(shí)間的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 二色補(bǔ)血草LbARP基因的克隆及序列分析

已構(gòu)建了0.4 mol/L NaHCO3脅迫下的二色補(bǔ)血草葉片及嫩莖的cDNA文庫，通過對(duì)文庫克隆的隨機(jī)測(cè)序和EST分析獲得LbARP基因的全長(zhǎng)cDNA序列。采用NCBI的開放讀碼框?qū)ふ页绦颍∣RF founder）確定該基因的開放讀碼框;用NCBI的Conserved Domains工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白的保守區(qū);通過ExPASY 網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）計(jì)算蛋白的分子量和理論等電點(diǎn);用BlastP程序進(jìn)行同源性搜索，并對(duì)具有同源性、不同植物來源的ARP蛋白用ClustalX（1.83）進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2 二色補(bǔ)血草LbARP基因在非生物脅迫逆境下的表達(dá)分析

1.2.1 材料處理。

將二色補(bǔ)血草種在溫室花盆中，生長(zhǎng)基質(zhì)為沙和草炭土（2∶1）。溫室的溫度為24 ℃，平均光強(qiáng)為400 μmol/（m2·S），相對(duì)濕度在65%～75%，每天澆水，保證土壤水分充足。種子萌發(fā)生長(zhǎng)60 d后，取二月齡的二色補(bǔ)血草幼苗，分別用0.2 mol/L NaCl、150 μmol/L CdCl2、150 μmol/L CuSO4、150 μmol/L ZnCl2和150 μmol/L ABA溶液澆灌土壤進(jìn)行脅迫處理。分別在脅迫后0 、6 、24、48 h 取二色補(bǔ)血草的葉片（地上部分）和根部組織，用蒸餾水清洗，拭干后置于-70 ℃中保存，用于RNA的提取。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量RTPCR分析基因的表達(dá)。

采取CTAB法提取二色補(bǔ)血草總RNA，并用DNaseΙ（Promega）消化，去除DNA。然后參照TaKaRa PrimeScriptTM RT 試劑盒（大連寶生物公司 Code：DRR037S），以消化后的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作定量RTPCR模板。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒為SYBR Green Realtime PCR Master mix（Toyobo Co.， Ltd， Osaka， Japan）。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 10 μl，引物各0.5 μl（10 μmol/L），水7 μl，模板2 μl。定量PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃ 12 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s;81 ℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)，然后在熒光定量PCR儀上完成RTPCR。用18srRNA（EU039827）和βTublin（EH793552）基因作為內(nèi)參基因。引物序列LbARP：上游：5′ TCAGACGTGCCTGCTTCTG 3′，下游：5′ CCATCTCCATGCCTACTACAG3′;18s rRNA：

上游：5′CCGTTCTTAGTTGGTGGAG3′，下游：5′CTCGTTGAATACATCAGTGTAG3′;βTublin：上游：5′GGTTGAGTGAGCAGTTCAC3′，下游：5′GATAACCAGACCACACCTTAGC3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 二色補(bǔ)血草LbARP基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及序列分析

經(jīng)BlastX分析顯示該基因cDNA全長(zhǎng)為698 bp，其中5′非翻譯區(qū)64 bp，3′非翻譯區(qū)247 bp，673～698位為Poly（A）尾巴。對(duì)其ORF進(jìn)行分析，自65位的ATG起，止于451位的TGA，開放閱讀區(qū)全長(zhǎng)為387 bp，共編碼128個(gè)氨基酸。通過ExPASY網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）在線分析，計(jì)算該基因編碼蛋白的分子量為13.84 kDa，理論等電點(diǎn)為9.69，此蛋白為堿性蛋白質(zhì)。根據(jù)該基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，以二色補(bǔ)血草的基因組DNA為模板擴(kuò)增LbARP的基因組序列，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。通過對(duì)LbARP基因組DNA序列及其cDNA序列比較分析確定該基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子（圖1）。

2.2 二色補(bǔ)血草LbARP基因的氨基酸序列分析

用NCBI的Conserved Domains工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白的保守區(qū)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，該基因具有一個(gè)典型的Auxin_repressed生長(zhǎng)素相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

圖1 二色補(bǔ)血草LbARP編碼區(qū)序列及由此推到的氨基酸序列

圖2 二色補(bǔ)血草LbARP蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 二色補(bǔ)血草LbARP與其他植物ARP蛋白氨基酸序列同源性

用NCBI的BlastP進(jìn)行同源性搜索，在GenBank的Nr數(shù)據(jù)庫共有100個(gè)與二色補(bǔ)血草LbARP氨基酸序列匹配的序列。隨機(jī)選擇9種與二色補(bǔ)血草LbARP蛋白氨基酸序列相似性較高的植物ARP氨基酸序列，用ClustalX（1.83）進(jìn)行多序列比對(duì)分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，這10種植物氨基酸序列的同源性較低，在51%～67%。

圖3 二色補(bǔ)血草LbARP氨基酸序列與其他9種植物ARP氨基酸序列比較

2.4 二色補(bǔ)血草LbARP基因在非生物脅迫中的表達(dá)模式

為了研究LbARP基因在鹽、ABA、重金屬不同脅迫處理下的表達(dá)模式，進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（圖4）。由圖4可知，在ABA脅迫下，LbARP基因在根中的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在脅迫24 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最高峰。在葉中LbARP的表達(dá)受到抑制，脅迫6 h后表達(dá)量最低。NaCl處理可以誘導(dǎo)LbARP基因在根和葉中的表達(dá)，且在脅迫6 h時(shí)表達(dá)量最大。CuSO4脅迫可以誘導(dǎo)LbARP基因在葉中的表達(dá)，而抑制其在根中的表達(dá)。ZnCl2處理時(shí)均可誘導(dǎo)LbARP基因在根和葉的表達(dá)，且表達(dá)量隨著時(shí)間進(jìn)程急劇上升，脅迫48 h后達(dá)到最大值。CdCl2脅迫下LbARR基因在根和葉中的表達(dá)受到了抑制。這說明LbARP基因能夠?qū)aCl、ABA、CuSO4、CdCl2及ZnCl2等非生物脅迫作出應(yīng)答。

注：A.150 μmol/L ABA;B.0.2 mol/L NaCl，C.150 μmol/L CuSO4，D.150 μmol/L ZnCl2，E.150 μmol/L CdCl2。

圖4 熒光定量PCR分析二色補(bǔ)血草中LbARP基因在根、葉中的表達(dá)模式

3 結(jié)論與討論

目前，生長(zhǎng)素抑制蛋白基因已從多種植物上分離出來。這些基因大部分是從休眠組織（或器官）或受到外界生物或非生物脅迫的組織（或器官）中分離出來的，所以推導(dǎo)該基因家族與植物的休眠或抗逆有關(guān)，但其具體功能尚不清楚。該研究從二色補(bǔ)血草cDNA文庫中分離出一條編碼生物素抑制蛋白基因，將其命名為L(zhǎng)bARP。生物信息學(xué)分析表明，LbARP基因具有一個(gè)典型的Auxin_repressed生長(zhǎng)素相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)定量RTPCR結(jié)果表明，在不同脅迫條件下LbARP基因的表達(dá)模式不同。NaCl和ZnCl2脅迫均能誘導(dǎo)LbARP基因在二色補(bǔ)血草根

和葉中的表達(dá)。ABA處理只能誘導(dǎo)LbAPR基因在二色補(bǔ)血草根

中的表達(dá)，而抑制其在二色補(bǔ)血草葉中的表達(dá)。相反，CuSO4脅迫時(shí)則能誘導(dǎo)LbARP基因在二色補(bǔ)血草葉中的表達(dá)，而抑制其在二色補(bǔ)血草根中的表達(dá)。CdCl2處理時(shí)，LbARP基因在二色補(bǔ)血草根

和葉中的表達(dá)均受到抑制。此外，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，

LbARP基因在二色補(bǔ)血草的根部和葉部的表達(dá)量有較大差異，說明該基因的表達(dá)具有一定的組織器官特異性。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) " " " " " " " " " " " " 2014年

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