摘要 [目的]建立一種快速簡便檢測羊原乳中牛原乳成分的方法。[方法]以牛IgG為檢測對象，建立了檢測羊乳中牛乳成分的競爭免疫層析法。[結(jié)果]試驗(yàn)建立的方法可以檢測出含有2%牛原乳的羊原乳，受基質(zhì)干擾較小。[結(jié)論]該方法具有簡便快捷等特點(diǎn)，可以用于羊原乳中牛原乳成分的快速檢測。

關(guān)鍵詞 羊原乳;牛原乳;牛IgG;競爭免疫層析法

中圖分類號 S879.1 "文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A "文章編號 0517-6611（2014）32-11496-02

Use of Competitive Immunochromatographic Method for the Detection of Adulteration of Goats’ Milk

ZHAO Fang1，ZHANG Huan2* "（1.Shenzhen EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)ood Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen，Guangdong 518067; 2.Fushun City Product Quality Supervision and Inspection，F(xiàn)ushun，Liaoning 113006）

Abstract "[Objective] Bovine IgG was used as detection protein and a i mmune chromatography assay was established for the detection of adulteration of goats’ milk.[Method] A lateralflow （LF） device was applied to detect bovine IgG in the goats’ milk.[Result] The detection limits of the method was 2% cows’ milk adulteration of goat.[Conclusion] The lateralflow （LF） device performance makes it suitable for development as a kit for use in routine surveillance of milk.

Key words "Goat milk; Cow milk; Bovine IgG; Lateralflow （LF） device

近年來，羊乳以營養(yǎng)豐富、易于吸收、不易導(dǎo)致過敏等優(yōu)點(diǎn)得到消費(fèi)者的廣泛認(rèn)可，成為我國乳制品消費(fèi)市場中增長速度最快的產(chǎn)品。最近10年我國羊乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，涌現(xiàn)出陜西、山東、河南等奶山羊養(yǎng)殖大省和一批羊乳加工龍頭企業(yè)，羊乳業(yè)已經(jīng)成為我國乳業(yè)的重要組成部分。2009年，我國羊乳產(chǎn)量121.79萬t，占奶類總產(chǎn)量的3.3%。

羊乳制品主要銷往長三角、珠三角等地區(qū)，年產(chǎn)值數(shù)十億元。由于羊乳營養(yǎng)價值較高且量少，其市場零售價是牛乳的1.5～2.0倍。企業(yè)收購羊乳的價格比牛乳高約20%。因而，羊乳摻假現(xiàn)象屢見不鮮，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。常見的羊乳摻假方式有摻水、摻牛乳、摻蔗糖、摻淀粉、摻米湯、摻硫氰酸鹽、摻豆?jié){、摻水解動物蛋白等。由于我國奶羊的飼養(yǎng)多采用 “公司+基地+農(nóng)戶”的經(jīng)營模式，使得羊乳摻假現(xiàn)象更為嚴(yán)重，因而有必要采取各種有效的手段打擊羊乳摻假現(xiàn)象，維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。

免疫學(xué)檢測以其高特異性、高靈敏性、簡便易行等優(yōu)勢已成為一種重要的快速檢測方法。筆者針對羊乳中摻入牛乳成分這一問題建立了一種快速簡便的免疫層析檢測方法，為羊乳產(chǎn)品的生產(chǎn)銷售提供一種行之有效的質(zhì)控方法。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗牛IgG、牛IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA）、蔗糖、檸檬酸鈉、碳酸鉀，購自美國SigmaAldrich公司;Tween20、NaCl、Tris、NaOH，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;氯金酸，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。PVC（聚氯乙烯）底板、8964玻璃纖維膜、吸水紙、硝酸纖維素膜（Sartorius 95），購自上海捷寧生物科技有限公司。1份山羊奶采集自陜西渭南農(nóng)戶，1份綿陽奶采集自陜西渭南某農(nóng)戶，1份牛奶（荷斯坦奶牛）采集自遼寧錦州某奶牛場，1份超高溫滅菌乳購自撫順某超市。豆?jié){自制：取100 g黃豆，加1 000 ml水，用九陽植物奶牛豆?jié){機(jī)磨成豆?jié){，用紗網(wǎng)濾除豆渣，備用。

1.2 方法

1.2.1 納米金顆粒的制備[1]。將100 ml超純水煮沸，加入1 ml 1% 氯金酸，快速攪拌，加入1 ml 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)快速攪拌30 s，低速攪拌14.5 min，按照3 μl/ml的比例加入0.2 mol/L碳酸鉀，混勻，備用。

1.2.2 金標(biāo)記牛IgG。取10 ml膠體金顆粒，加入30 μl 0.2 mol/L碳酸鉀，渦旋混勻;加入10 μg牛IgG，渦旋混勻，室溫靜置15 min;加入1 ml 10% BSA，渦旋混勻，室溫靜置15 min;10 000 r/min離心10 min;加入5 ml 復(fù)溶液[20 mmol/L Tris（pH 7.0），0.5%BSA，5%蔗糖]，重懸顆粒，備用。

1.2.3 結(jié)合墊的制備。將6 mm寬8964玻璃纖維膜浸入處理液[100 mmol/L Tris （pH 7.0），1%蔗糖，1%BSA，0.5% Tween20]，取出，置于室溫干燥過夜，備用;將處理過的8964玻璃纖維膜浸入金標(biāo)記兔抗牛IgG液體中，取出，37 ℃過夜晾干，兩端各剪掉1 cm，備用。

1.2.4 樣品墊的制備。將10 mm寬8964玻璃纖維膜浸入處理液[100 mmol/L Tris （pH 7.0），1%蔗糖，1%BSA，0.5% Tween20]，取出，置于室溫干燥過夜，備用。

1.2.5 硝酸纖維素膜。T線：用包被液[50 mmol/L Tris（pH 7.5），3%蔗糖]將兔抗牛IgG稀釋至2 mg/ml，按照1 μl/cm噴膜，37 ℃干燥3 d，備用。C線：將SPA稀釋至0.2 mg/ml，按照1 μl/cm噴膜，室溫干燥過夜，備用。

1.2.6 試紙條組裝。將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次搭接粘貼在PVC底板上，裁成3.5 mm寬的試紙條，2～8 ℃干燥保存。

1.2.7 檢測樣品。將樣品用50 mmol/L NaCl稀釋1倍。將試紙條平放于臺面上，取50 μl稀釋過的樣品于樣品墊上，3～10 min觀察結(jié)果，T、C線均為紅色時為含牛乳成分奶，只有C線顯色時樣品中不含牛乳成分或者含有低于此方法檢測下限的牛乳成分，T、C線均為不顯色或者C線不顯色時結(jié)果無效。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測下限 向山羊奶中添加牛奶，使牛奶含量分別達(dá)到0、1%、2%、5%、10%、20%、40%、80%、100%，用所制備的試紙條檢測上述樣品，每個濃度重復(fù)檢測5次。由表1可知，當(dāng)牛奶含量達(dá)到2%時即可被穩(wěn)定檢測出。

表1 試紙條檢測羊乳中牛乳檢測下限分析

牛奶含量

%檢測結(jié)果（陽

性/檢測數(shù)）牛奶含量

%檢測結(jié)果

（陽性/檢測數(shù)）

00/5205/5

13/5405/5

25/5805/5

55/51005/5

105/5

2.2 基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響 分別向山羊奶中添加綿陽奶、豆?jié){，使之含量分別達(dá)到0、0.75%、1.50%、3.10%、6.25%、12.50%、25.00%、50.00%、100%，用所制備的試紙條檢測上述樣品，每個濃度重復(fù)檢測5次，詳細(xì)結(jié)果見表2。檢測結(jié)果顯示，添加綿陽奶并不會出現(xiàn)假陽性，而添加豆?jié){到1.50%即可出現(xiàn)假陽性。

表2 基質(zhì)對免疫層析檢測的影響

含量∥%綿陽奶（陽性/檢測數(shù)）豆?jié){（陽性/檢測數(shù)）

00/50/5

0.750/50/5

1.500/53/5

3.100/53/5

6.250/54/5

12.500/55/5

25.000/53/5

50.000/55/5

1000/55/5

2.3 蛋白質(zhì)變性對檢測結(jié)果的影響 分別往羊奶中添加煮沸的牛奶、超高溫滅菌乳，使其含量分別達(dá)到0、0.75%、1.50%、3.10%、6.25%、12.50%、25.00%、50.00%、100%，采用該研究研制的試紙條對其進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陰性（詳細(xì)見表3）。

3 討論

向羊乳中摻水、摻牛乳、摻蔗糖、摻淀粉、摻米湯、摻硫氰酸鹽、摻豆?jié){、摻水解動物蛋白等嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。目前，已有多種方法檢測這一損害消費(fèi)者利益的現(xiàn)象。主要有電泳分析[2-3]、色譜分析[4]、分子生物學(xué)分析[5]、免疫學(xué)分析[6-7]等。其中，免疫學(xué)方法以其簡便、快捷、檢測成本低等

表3 蛋白質(zhì)變性對檢測結(jié)果的影響

含量∥%煮沸牛奶（陽性/檢測數(shù)）超高溫滅菌乳（陽性/檢測數(shù)）

00/50/5

0.750/50/5

1.500/50/5

3.100/50/5

6.250/50/5

12.500/50/5

25.000/50/5

50.000/50/5

1000/50/5

優(yōu)勢成為一種重要的檢測方法。目前，針對羊乳摻雜牛乳的免疫學(xué)方法主要是針對牛乳中特定蛋白進(jìn)行免疫學(xué)檢測，如：牛乳清蛋白[6]、β酪蛋白[8]、γ酪蛋白[9]、牛IgG[10-11]等。該研究以牛乳中IgG為檢測對象，建立了快速檢測羊乳摻雜牛乳的競爭免疫學(xué)檢測方法。該方法具有合適的檢測下限，既可避免在羊乳生產(chǎn)過程中因容器具受牛源成分污染而引起假陽性，又可檢測出人為添加牛乳到羊乳問題，而且具有較強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力（除豆?jié){會導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)外），適用于羊原乳中牛原乳成分的快速檢測。

參考文獻(xiàn)

[1]

FRENS G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J].Nature Physical Science，1973，241：20-22.

[2] ASCHAFFENBURGA1 R，DANCEA1 J E.Detection of cow's milk in goat's milk by gel electrophoresis[J].Journal of Dairy Research，1968，35（3）：383-384.

[3] FURTADO M M.Detection of cow milk in goat milk by polyacrylamide gel electrophoresis[J].J Dairy Sci，1983，66（9）：1822-1824.

[4] VELOSO A C，TEIXEIRA N，F(xiàn)ERREIRA I M.Separation and quantification of the major casein fractions by reversephase highperformance liquid chromatography and ureapolyacrylamide gel electrophoresis.Detection of milk adulterations[J].J Chromatogr A，2002，967（2）：209-218.

[5] RODRIGUES N P A，GIVISEIEZ P E N，QUEIROGA R C R E，et al.Milk adulteration：Detection of bovine milk in bulk goat milk produced by smallholders in northeastern Brazil by a duplex PCR assay[J].J Dairy Sci，2012，95（5）：2749-2752.

[6] GARCIA T，MARTIN R，RODRIGUE Z E，et al.Detection of bovine milk in ovine milk by an indirect enzymeLinked immunosorbent assay[J].Dairy Sci，1990，73（6）：1489-1493.

[7] ANGUITA G，MARTIN R，GARCA T，et al.A competitive enzymelinked immunosorbent assay for detection of bovine milk in ovine and caprine milk and cheese using a monoclonal antibody against bovine betacasein[J].J Food Prot，1997，60（1）：64-66.

[8] ANGUITA G，MARTN R，GARCA T.Indirect ELISA for detection of cow’s milk in ewes’ and goats’ milk using a monoclonal antibody against bovin βcasein[J].Journal of Dariy Research，1995，62：655-659.

[9] RICHTER W，KRAUSE I，GRAF C.An indirect competitive ELISA for the detection of cows’ milk and caseinate in goats’ and ewes’ milk and cheese usingpoly clonal antibodies against bovine γcaseins[J].Chemistry and Materials Science，1997，204（1）：21-26.

[10] HURLEY "I P，COLEMAN R C，IRELAND H E，et al.Measurement of bovine IgG by indirect competitive ELISA as a means of detecting milk adulteration[J].Journal of Dairy Science，2004，87：215-221.

[11] HURLEY I P，COLEMAN R C，IRELAND H E，et al.Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese[J].International Dairy Journal，2006，16：805-812.