摘要 介紹了龜甲近13年來在鑒別、活性成分及藥理方面的研究進展，建議今后龜甲的研究利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，建立一個快速準確鑒別龜甲的方法，結(jié)合中醫(yī)辨證論治理論和現(xiàn)代先進的科技手段，發(fā)現(xiàn)龜甲的活性成分及其調(diào)控機制，從而能為龜甲的質(zhì)量控制提供理論和實驗依據(jù)，才能進一步開發(fā)出龜甲的巨大藥用價值。

關(guān)鍵詞 龜甲;鑒別;活性成分;藥理

中圖分類號 S185 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11319-02

Research Progress of the Carapax et Plustrum Testudinis

DU Peilin， ZHOU Yuqing， ZHU Hua*

（Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530001）

Abstract This article introduced the research progress in the identification， active ingredients and pharmacology of Carapax et Plustrum Testudinis during the past 13 years. Future studies should use modern molecular biological techniques to create a fast， accurate method for identification and combine the theory of Chinese medicine and modern techniques to find the active ingredients and their regulatory mechanisms， in order to provide theoretical and experimental evidences for the quality control of Carapax et Plustrum Testudinis. In this way it can provide theoretical and experimental basis for its quality control and further develop the huge medicinal values.

Key words Carapax et Plustrum Testudinis; Identification; Active ingredients; Pharmacology

基金項目 廣西自然科學基金創(chuàng)新研究團隊項目（2011GXNSFF018006）;廣西壯瑤藥重點實驗室（桂科基字【2014】32號）;壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心（桂教科研【2013】20號）;“中藥創(chuàng)新理論與藥效研究”八桂學者項目;廣西高校重點學科（壯藥學）項目（桂教科研【2014】14號）。

作者簡介 杜沛霖（1988- ），男，湖北十堰人，碩士研究生，研究方向：中藥鑒定。*通訊作者，教授，博士生導師，從事中藥鑒定方面的研究。

收稿日期 20140930

龜甲（Carapax et Plustrum Testudinis）為龜科動物烏龜（Chinemys reevesii（Gray））的背甲及腹甲[1]，別名神屋、龜殼、敗龜甲、元武版、坎版、拖泥版、烏龜版、龜筒、龜版、敗龜、敗龜版、龜?shù)装娴龋渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品[2]。龜甲具有滋陰潛陽、益腎強骨、養(yǎng)血補心的功效，用于治療陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈目眩、虛風內(nèi)動、筋骨痿軟和心虛健忘等癥狀[1]。筆者對近13年以來國內(nèi)對龜甲的鑒別、活性成分、藥理學方面的研究進展進行綜述。

1 鑒別研究

1.1 原動物性狀鑒別 朱照祥[3]采用科屬與性狀特征結(jié)合的方法——以甲橋、腋盾、胯盾、上下甲間韌帶、盾片、棱嵴等特征為分類，鑒別了龜甲及其30多個偽品的原動物。易紅兵[4]分析了正品烏龜與龜甲及其3種偽品在盾片上的斑紋形態(tài)、顏色及各盾片間的連接縫長短特征上的差異，該法對炮制加工后的龜甲飲片也能夠快速鑒別其真?zhèn)?。研究人員還鑒別了龜甲及其常見偽品原動物的形狀特征[5-6]。

1.2 藥材顯微鑒別 有人觀察對比了龜甲及其偽品的骨碎片及角質(zhì)碎片在顏色、紋理和色素點等方面的顯微特征，但特征差異小，不足以作為龜甲真?zhèn)舞b別的特征[7-8]。

1.3 分子生物學鑒別 劉曉帆等[9]提取龜甲及其混偽品的DNA，得到COI序列后用 Contig Express、Dnaman、Edit Sequence和Mega等軟件分析其變異位點，構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹圖，結(jié)果表明烏龜形成一個獨立的支，偽品聚集為獨立的一支，說明COI序列作為條形碼可以鑒別龜甲正品與混偽品。

2 活性成分研究

2.1 礦物質(zhì)元素 汪祿祥[10]等運用離子發(fā)射光譜儀測定龜甲礦物質(zhì)元素，發(fā)現(xiàn)龜甲含有21種礦物質(zhì)，其中又以磷、鈣、硒、鍶、鋇和硅的含量較高。薛錚[11]建立了電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICPAES法）測定龜板中常量和微量元素的方法和條件，回收率為90.9%～109.1%，RSD為0.5%～4.0%。

2.2 多酚類物質(zhì) 高姚湘等[12]首次利用FolinCiocalteu比色法，以沒食子酸為標準品，測定龜甲內(nèi)抗氧化的主要成分總多酚類物質(zhì)的含量，該方法穩(wěn)定可靠，準確方便，可用于龜甲中的多酚含量測定。

2.3 甾體類 姜大成等[13]首次從龜甲的滋陰有效部位醇提醚溶部，分離并鑒定出2個甾體類化合物，即十六烷酸膽甾醇酯和膽甾醇。雷鈞濤等[14]建立了測定龜甲中膽甾4，6二烯3醇含量的薄層掃描法。陳薇等[15]對龜板提取物浸膏經(jīng)硅膠柱層析，梯度洗脫，得到16個組分，并用 HPLC 和 9 個標準物質(zhì)鑒定出十六酸甲酯、十六酸乙酯、十八酸甲酯、十四酸甾醇酯和十八酸，采用MTT 法和流式細胞儀研究了它們對鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rMSCs）的增殖作用，結(jié)果表明十四酸甾醇酯和十六酸甲酯具有促進 rMSCs 增殖的作用，而十八酸對rMSCs的增殖具有抑制作用。

2.4 羥脯氨酸 駱達等[16]建立了柱前衍生化法測定龜甲中膠原蛋白的含量的方法，即將龜甲中膠原蛋白經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生化后，以醋酸鈉溶液-乙腈與乙腈-水為二元流動相，經(jīng)C18色譜柱分離，于波長254 nm處測定羥脯氨酸含量。王新雨等[17]建立了利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法（HPLCELSD）直接測定醋龜甲中羥脯氨酸含量，樣品不需要衍生即可直接分析，避免了衍生產(chǎn)物的多樣性，操作簡便、結(jié)果可靠。

2.5 脂肪酸 方文忠等[18]采用GCMS測定法對龜板提取的甲酯化樣品進行GCMS分析，質(zhì)譜圖用NISTO5s.LIB和NISTO5.LIB譜圖檢索，鑒定各種脂肪酸，并用色譜峰而積歸一化法測定其相對百分含量，發(fā)現(xiàn)龜板中含有13種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占70.21%。

3 藥理研究

3.1 抗氧化活性作用 謝學明等[19]采用1，1二苯基2苦基肼基游離基（DPPH）法對比研究了龜甲石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇提取部位的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，抑制率不斷增加，其中又以95%乙醇部位提取物抑制作用最強。采用DPPH法比較海南產(chǎn)龜板與湖北漢陽產(chǎn)龜板的抗氧化活性，前者比后者強，具有顯著性差異（Plt;0.01）[20]。

3.2 抗脂質(zhì)過氧化作用 李熙燦等[21]將50只SD大鼠隨即分成5組，受試組分別注射不同質(zhì)量濃度的龜板醇提物，陽性對照組注射維生素E，對照組注射燈亮的蒸餾水;每天1次，7 d后分別用TBA比色法和亞硝酸鹽法測定大鼠肝中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，發(fā)現(xiàn)受試組MDA水平顯著下降，SOD活性顯著提高，表明龜板醇提物具有抗脂質(zhì)過氧化作用。

3.3 骨髓間充質(zhì)干細胞增殖促進作用 骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）可以分化為神經(jīng)細胞，由氧化而導致的自由基損傷可能是影響干細胞移植效果的重要因素之一。李熙燦等[21]采用密度梯度法分離大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC），培養(yǎng)3代后加入H2O2損傷3 h造成MSC氧化損傷模型;試驗組加入不同質(zhì)量濃度的龜甲醇提物，24 h后用MTT法測定細胞活性，發(fā)現(xiàn)與H2O2損傷組存在顯著差異，且濃度越大，修復能力越強，說明龜甲醇提物具有修復MSC氧化損傷的作用。陳東風等[22-23]將SD大鼠隨機分組，采用大腦中動脈線栓法造成大鼠局灶性腦缺血模型，試驗組給予龜板口服液，用免疫組織化學技術(shù)檢測神經(jīng)上皮干細胞蛋白（Nestin）與腦組織3種亞型NOS（nNOS、iNOS、eNOS）的表達，與對照組相比，試驗組室管膜下區(qū)Nestin陽性細胞顯著增多，nNOS、iNOS免疫陽性細胞較少，eNOS免疫陽性細胞較多;用Zea Longa評定神經(jīng)功能缺損程度，發(fā)現(xiàn)試驗組神經(jīng)功能缺損程度較輕（P<0.05）。這說明龜甲水煎液能降低腦缺血再灌注后iNOS、nNOS過度表達所形成的NO神經(jīng)毒性，提高源于eNOS產(chǎn)生的NO神經(jīng)保護作用，上調(diào)腦缺血再灌注大鼠Nestin的表達，由于Nestin是神經(jīng)干細胞的標志性蛋白，說明龜甲能促進神經(jīng)干細胞的增殖，從而進一步達到促進生長發(fā)育的作用。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，龜甲能促進MSC的增殖[24]，從而達到促進生長發(fā)育的作用[25-26]。在長時間誘導后，MSC還可能向成骨方向分化[27]，其機制是通過上調(diào)增殖細胞核抗原來實現(xiàn)的[28]。

3.4 抑制細胞凋亡作用 陳蘭等[29]用紫外線直接照射細胞造成損傷模型，用龜板各成分對照培養(yǎng)，用流式細胞儀檢測FITCAnnexin V和碘化丙錠（PI）雙標，結(jié)果表明早期凋亡率（LR）、正常率（LL）與對照組均存在顯著性差異，說明龜板提取物具有較好的抗表皮干細胞凋亡作用。曹佳會[30]采用血清饑餓3 d的方法建立PC12細胞凋亡模型，將細胞分為對照組、模型組、龜甲提取物低、高劑量組，在施加處理因素3 d后，用MTT比色分析法測定細胞吸光度值，Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率，Western blotting檢測Caspase3和BMPs信號通路的表達水平，并檢測BMPs信號通路阻斷后TCPE的抗凋亡作用，用BioRad Quantity One凝膠分析系統(tǒng)對條帶進行半定量分析，結(jié)果表明龜甲提取物具有抑制血清饑餓誘導PC12細胞凋亡的作用，其作用機制可能與激活BMP4信號通路表達有關(guān)。

3.5 提高免疫力作用 顧迎寒等[31]用甲狀腺片和利血平溶液給小鼠造模，陰虛小鼠的甲狀腺、胸腺、脾臟和腎上腺明顯萎縮，給予龜甲水提液后，觀察其體重、自主活動和耐缺氧能力指標的變化，試驗結(jié)束后解剖取出小鼠的甲狀腺、胸腺、脾臟和腎上腺，準確稱重，計算其臟器指數(shù)，試驗數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明龜甲對陰虛小鼠體重減輕、自主活動減少、耐缺氧能力減弱和甲狀腺、胸腺、脾臟、腎上腺的萎縮都具有一定的抑制作用，說明龜甲具有增強免疫力的作用。

4 討論

（1）通過筆者走訪調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前市場對龜甲的質(zhì)量控制多依賴于原動物鑒別環(huán)節(jié)，炮制加工后鑒別難度加大，市場上偽品與混淆品泛濫，因此還需要借鑒并引進分子生物技術(shù)等其他學科誕生的新技術(shù)與新方法，建立一個快速、準確鑒別龜甲的方法。

（2）由于目前對支撐龜甲藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制的研究十分薄弱，龜甲的代表性成分尚不清楚，在質(zhì)量控制上缺乏具有說服力的指標。因此，以中醫(yī)藥理論為指導，以滋陰潛陽、益腎強骨、養(yǎng)血補心作用為導向，結(jié)合中醫(yī)辨證論治理論和現(xiàn)代先進的科技手段研究龜甲的活性成分及其調(diào)控機制，才能為龜甲的質(zhì)量控制提供理論和試驗依據(jù)，才能進一步開發(fā)出龜甲的巨大藥用價值。

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