摘要 [目的]研究了雙孢菇搖瓶孵育時(shí)不同氮源及碳氮比的優(yōu)化配比以及雙孢菇的成長(zhǎng)優(yōu)化條件，為野生菌種質(zhì)資源保存和馴化提供借鑒之法。[方法]采用7種有機(jī)氮源、4種無機(jī)氮源，構(gòu)成8個(gè)碳氮比梯度，研究菌球直徑、菌球密度、菌絲生長(zhǎng)量等生物量指標(biāo)，考察雙孢菇搖瓶孵育條件、氮代謝特性。[結(jié)果]通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別優(yōu)化了雙孢菇液體發(fā)酵培養(yǎng)的碳氮源最佳組合以及無機(jī)鹽的最佳組合，得到了雙孢菇液體發(fā)酵的適宜培養(yǎng)基：葡萄糖3% 、木糖3%、蛋白胨0.3%、黃豆芽5% 、KH2 PO4 0.1% 、MgSO4·7H2O 0.05%、（NH4）2 SO4 0.2%， pH5.5，溫度35 ℃。采用優(yōu)選氮源、濃度梯度，顯著或極顯著改觀雙孢菇成長(zhǎng)。黃豆、黃豆芽是雙孢菇斜面培養(yǎng)基的良好氮源，菌球密度分別達(dá)到27.64%和25.00%，是對(duì)照的162%和142%。其次是蛋白胨、酵母膏差異顯著，而甘氨酸與硫酸銨、硝酸鉀做氮源之間差異不顯著，尿素是最差的氮源。3.1%黃豆芽和黃豆均可產(chǎn)生最大雙孢菇生物量，可取代蛋白胨、酵母膏的有機(jī)氮源。適宜雙孢菇生長(zhǎng)的碳氮比為35∶1。[結(jié)論]雙孢菇培養(yǎng)時(shí)存在氮源的選擇性差異，有機(jī)氮源優(yōu)于其他氮源，同時(shí)氮源梯度極顯著影響斜面種產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞 雙孢菇;斜面培養(yǎng);氮源;碳氮比

中圖分類號(hào) S646 "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A "文章編號(hào) 0517-6611（2014）32-11247-03

Study on Optimization of Culture Condition of Agaricus bisporus Submerged Fermentation

WANG Li1， WANG Feng2， WU Xing3 "（1. Inspection College of Ningxia Medical University， Yingchuan，Ningxia 750004; 2. Wuzhong People Hospital， Wuzhong， Ningxia 750004;3.Yanchi County of Ningxia Agricultural Extension Service Center，Yanchi，Ningxia 751500）

Abstract "[Objective] With Agaricus bisporus flask incubation， the proportion of different nitrogen sources and carbon nitrogen ratio was optimized， and the optimum conditions for the growth of Agaricus bisporus was studied， so as to provide reference for wild mushroom germplasm resources.[Method] 7 kinds of organic nitrogen source， 2 kinds of inorganic nitrogen sources and 8 ratio of carbon to nitrogen gradient were adopted. Ball diameter， bacteria density and amount of mycelium biomass，etc were studied to inspect the flask incubation condition and nitrogen metabolic characteristics of Agaricus bisporus. [Result]Through orthogonal design test， the optimum combination of the double spore mushroom liquid fermentation and the best combination of carbon and nitrogen source and inorganic salts were studied， resulting in a suitable medium of Agaricus bisporus liquid fermentation of glucose xylose： glucose 3%， xylose 3%， peptone 0.3%， yellow bean sprouts 5%， KH2 PO4 0.1%， MgSO4·7H2O 0.05%， （NH4）2 SO4 0.2%， pH 5.5， temperature 35 ℃. The optimum nitrogen source and concentration gradient significantly or extreme significantly changed the double spore mushroom growth. Soybean and bean sprouts were good nitrogen sources of Agaricus bisporus slant medium， and pellet density reached 27.64% and 25%， which were 162% and 142% of the control. The second was peptone and yeast extract significantly， while glycine and ammonium sulfate， potassium nitrate had no significant difference between nitrogen source， nitrogen source urea was the worst. 3.1% yellow bean sprouts and soybeans could produce maximum double spore mushroom biomass， but organic nitrogen source could be instead of peptone and yeast extract. Carbon and nitrogen ratio suitable for mushroom growth was 35∶1. [Conclusion] Agaricus bisporus cultivation in nitrogen sources had difference， and the organic nitrogen source was better than the other nitrogen sources， while nitrogen source gradient significantly affected the slope of the yield.

Key words "Agaricus bisporus; Slant cultivation; Nitrogen source; Carbon nitrogen ratio

雙孢菇（Agaricus bisporus），又稱白蘑菇、洋蘑菇，簡(jiǎn)稱蘑菇。雙孢菇不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有“植物肉”的美稱，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，而且具有很好的降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌、消炎護(hù)肝等多種保健價(jià)值。雙孢蘑菇是一種單因子次級(jí)同宗配合方式進(jìn)行遺傳的食用真菌。

氮源是食用菌合成細(xì)胞壁、核酸和蛋白質(zhì)等的主要原料。蛋白胨、氨基酸、酵母膏、尿素、豆餅、麥麩、米糠和畜禽等有機(jī)氮和氨、銨鹽、硝酸鹽等無機(jī)氮可以作為食用菌的氮源，與碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)構(gòu)成（19～45）∶1的碳氮比。雙孢菇與其他種類食用菌一樣存在著氮源種類和濃度的選擇性利用。對(duì)雙孢菇菌的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基組分中的碳源、氮源、無機(jī)鹽種類進(jìn)行選擇性試驗(yàn)分析，以期獲得最適碳源、氮源、無機(jī)鹽及最優(yōu)配比。酵母膏和蛋白胨是雙孢菇搖瓶深層發(fā)酵的最佳氮源，因此開展氮源種類和濃度的優(yōu)化是雙孢菇雜交育種、提純復(fù)壯以及生理生化研究的前提。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。雙孢菇斜面菌種，為寧夏醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。葡萄糖、氯仿、苯酚、硫酸、正丁醇， 均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 雙孢菇提取物的常規(guī)分析。

水分含量測(cè)定采用干燥法GB5009.32003;灰分含量測(cè)定采用高溫灼燒法GB5009.42003;蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法GB5009.52003;粗脂肪含量測(cè)定采用索氏抽提法GB5009.62003;粗纖維含量測(cè)定采用酸性洗滌法;還原糖的測(cè)定采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法。

1.2 方法

搖瓶培養(yǎng)法轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度35 ℃，每瓶50 ml培養(yǎng)基?；罨囵B(yǎng)基配制與菌絲體活化以雙孢菇一號(hào)品種為試驗(yàn)材料。Mandels培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌30 min，滅菌后趁熱倒搖瓶培養(yǎng)基，自然冷卻。 " 在超凈工作臺(tái)上取少許試管種，每個(gè)搖瓶培養(yǎng)瓶接菌種，于25 ℃環(huán)境溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲體快生長(zhǎng)滿搖瓶時(shí)結(jié)束菌絲體活化生長(zhǎng)，進(jìn)入液體培養(yǎng)基試驗(yàn)階段。不同氮源、碳源和碳氮比見表1。

表1 不同氮源、碳源和碳氮比、收菇時(shí)的蛋白質(zhì)含量

碳氮源碳氮比葡萄糖木糖蛋白質(zhì)含量∥%

蛋白胨 "42 "45 "42

畜禽3537 36

酵母膏 "37 "40 "40

尿素 20 19 23

豆餅 38 35 39

麥麩 34 31 37

米糠 33 32 26

氨基酸 30 29 29

氨394137

銨鹽 41 40 40

硝酸鹽 "35 "34 "34

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇提取物常規(guī)分析結(jié)果

雙孢菇提取物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）中，水分7.91%，灰分16.14%，蛋白質(zhì)42%，粗脂肪0.16%，粗纖維0.06%，碳水化合物33.73%。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=4.927X+0.035 9。經(jīng)計(jì)算，粗提物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.6%。

2.2 不同氮源影響雙孢菇液體種的生長(zhǎng)

優(yōu)化比較

7種有機(jī)氮源和4種無機(jī)氮源。經(jīng)方差分析，發(fā)現(xiàn)黃豆、黃豆芽培養(yǎng)基菌球直徑與其他培養(yǎng)基之間存在0.01水平顯著性差異，是最好的氮源供給種類，黃豆、黃豆芽培養(yǎng)基菌球密度分別達(dá)到27.64%和25.00%;其次是蛋白胨、酵母膏，二者之間差異不顯著：尿素是最差的氮源，比供試無機(jī)氮源還差，甘氨酸與無機(jī)氮源的硫酸銨、硝酸鉀之間差異不顯著，而無機(jī)氮源中銨態(tài)氮的選擇利用效果優(yōu)于硝態(tài)氮。當(dāng)以黃豆芽為氮源時(shí)新生菌絲體生長(zhǎng)量最高達(dá)12 kg/m2，而銨鹽、酵母膏、蛋白胨次之，以尿素作為氮源時(shí)菌絲的生長(zhǎng)量最低，僅有3 kg/m2?？傮w而言，對(duì)有機(jī)氮的利用基本好于無機(jī)氮，對(duì)尿素則幾乎不利用。

2.3 氮源梯度影響雙孢菇液體種的生長(zhǎng)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)的碳氮培養(yǎng)基都有利于液體種生長(zhǎng)。例如，黃豆、黃豆芽培養(yǎng)基生產(chǎn)的菌絲球個(gè)數(shù)分別是以蛋白胨為氮源的常規(guī)培養(yǎng)基配方下菌絲球個(gè)數(shù)的2、4倍。種植黃豆的培養(yǎng)基是可以取代蛋白胨作為有機(jī)氮源培育雙孢菇液體種。

圖1 優(yōu)化雙孢菇生長(zhǎng)條件的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景

2.4 "碳氮比影響雙孢菇液體種的生長(zhǎng) 優(yōu)化雙孢菇生長(zhǎng)條件的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景見圖1。通過不同碳氮比配方試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)蛋白胨、酵母膏配方都顯著或極顯著優(yōu)于其他處理，雙孢菇菌球直徑、菌球密度、菌絲球個(gè)數(shù)、接種塊上新生菌絲長(zhǎng)度均達(dá)到最大值，分別為26 cm、27.64%和25.00%、60個(gè)/cm2、30 cm。當(dāng)菌絲體增加，收菇時(shí)，雙孢菇菌球密度、菌絲球個(gè)數(shù)、菌絲長(zhǎng)度分別是27.64%和25.00%、60個(gè)/cm2和35 cm。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，適宜雙孢菇生長(zhǎng)的碳氮比是35∶1。

2.5 最佳發(fā)酵條件的確定

選擇L9 （33）進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件（表2、3）。由表2可知，三因素對(duì)菌絲體多糖含量的影響順序?yàn)樘荚磄t;氮源gt;pH 。菌絲體多糖積累的最佳培養(yǎng)基為： 葡萄糖3%、木糖3%、蛋白胨0.3%、黃豆芽5% 、KH2 PO4 "0.1% 、MgSO4.7H2O 0.05%、（NH4）2 SO4 0.2%，pH 5.5，溫度35 ℃。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

水平葡萄糖+黃豆芽∥%木糖+酵母膏∥%pH

11+20.2+55.5

22+20.4+56.5

33+20.6+57.0

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

試驗(yàn)號(hào)因素ABC多糖含量

g/L

11116.30

21226.90

31337.20

42125.30

52238.90

62318.40

731311.53

832112.65

933213.46

K123.0019.3425.37

K220.0027.5425.69

K335.4329.6126.89

R16.8315.344.37

3 結(jié)論與討論

通過雙孢菇液體種對(duì)7種有機(jī)氮源和4種無機(jī)氮源的優(yōu)化選擇利用研究，發(fā)現(xiàn)雙孢菇液體對(duì)有機(jī)氮源中的黃豆、黃豆芽、酵母膏、蛋白胨物質(zhì)的利用優(yōu)于無機(jī)氮源中硫酸銨、硝酸鉀，天然氮源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)黃豆和黃豆芽可以完全替代酵母膏和蛋白胨，對(duì)有機(jī)氮源中的尿素的利用效果最差。在通常情況下，食藥用菌液體深層培養(yǎng)的最佳氮源為酵母膏、豆餅粉，蛋白胨次之。在雙孢菇深層培養(yǎng)中，酵母膏和蛋白胨是首選有機(jī)氮源，其次是鉬酸銨、草酸銨、硫酸銨和硝酸銨，而硝酸鉀和尿素不作為培養(yǎng)該菌的氮源使用。

氮源種類、碳氮比優(yōu)化對(duì)雙孢菇液體種生長(zhǎng)的效應(yīng)研究表明，雙孢菇對(duì)不同氮源物質(zhì)的代謝能力有所不同[1-5]。通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別優(yōu)化了雙孢菇液體發(fā)酵培養(yǎng)的碳氮源最佳組合以及無機(jī)鹽的最佳組合，從而得到雙孢菇液體發(fā)酵的適宜培養(yǎng)基：葡萄糖3%、木糖3%、蛋白胨0.3%、黃豆芽5%、KH2 PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、（NH4）2 SO4 0.2%，pH "5.5，溫度35 ℃。

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