摘要 [目的]為探究花生在不同鈣素水平下氮代謝特點(diǎn)。[方法]選用606為試驗(yàn)材料，鈣素設(shè)4個(gè)水平，測定不同生育時(shí)期主要氮代謝酶（硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（GDH））活性及各葉片、莖稈和籽仁中蛋白質(zhì)含量。[結(jié)果]施用鈣肥不僅提高花生不同生育時(shí)期葉片中NR、GS、GOGAT和GDH活性，而且促進(jìn)花生植株對氮素的吸收，增加籽仁中蛋白質(zhì)含量。[結(jié)論]施鈣量為300 kg/hm2時(shí)，效果最好。

關(guān)鍵詞 鈣肥;氮代謝;花生

中圖分類號 S143 "文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11289-03

Effects of Different Ca Fertilizer Applications on Nitrogen Metabolism in Peanut

WANG Yuanyuan1， WANG Xianyun1， REN Jia1，LI Xiangdong2* et al

（1.Zhoucun Meteorological Administration， Zibo， Shandong 255300;2.BioTech Research Center，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100）

Abstract [Objective] The experiment aimed to study the nitrogen metabolism under different levels of calcium applying in peanut. [Method] Taken 606 as the test material， four different levels of calcium were set， and the main nitrogen metabolism enzyme （nitrate reductase （NR）， glutamine synthetase （GS）， glutamate synthase （GOGAT） and glutamate dehydrogenase （GDH）） activity at different growth stage and the protein content in leaves， stems， kernels were determined.[Result] The enzyme activity of NR， GS， GOGAT and GDH was significantly increased by the application of calcium at different growth stage. The application of calcium fertilizer improved the absorption of nitrogen in peanut and the protein content in the seed kernel. [Conclusion]300 kg/hm2 Ca had the best effect.

Key words Peanut; Calcium fertilizer; Nitrogen metabolism

植株體內(nèi)的氮素代謝是一個(gè)相當(dāng)重要的生理過程。它直接影響到花生品質(zhì)。蛋白質(zhì)是氮素代謝的最終產(chǎn)物，與花生品質(zhì)呈正相關(guān)。硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）等氮代謝酶在蛋白質(zhì)合成過程中起著決定性的作用[1]?；ㄉ切桠}量大的作物，每形成100 kg莢果吸鈣量達(dá)2.0～2.5 kg。缺鈣會導(dǎo)致花生空殼、爛果。前人對施鈣對花生生理特性、產(chǎn)量及品質(zhì)方面的影響已有較多的研究，但對施鈣改善花生品質(zhì)機(jī)理方面的研究較少。在大田條件下，筆者研究了不同鈣素水平下花生主要氮代謝酶活性和各器官蛋白質(zhì)積累規(guī)律，旨在揭示其在不同鈣素水平下的氮代謝特點(diǎn)，以期為花生品質(zhì)生理和合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2011～2012年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)站花生試驗(yàn)田進(jìn)行。0～20 cm土層土壤肥力狀況為：有機(jī)質(zhì)14.10 g/kg，堿解氮49.0 mg/kg，速效磷（P2O5）5.2 mg/kg，速效鉀（K2O）76.0 mg/kg，代換性鈣108.24 mg/kg。選用大花生品種606，行距30 cm，穴距20 cm，每穴播2粒，種植密度為15萬穴/hm2，鈣肥為氧化鈣，施在結(jié)果層。播前基施尿素500 kg/hm2、磷酸銨1 000 kg/hm2，按一般高產(chǎn)田進(jìn)行管理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為CK不施鈣，Ca150 150 kg/hm2（氧化鈣，下同），Ca300300 kg/hm2，Ca450 450 kg/hm2。小區(qū)面積為12.6 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。

5月18日播種，9月19日收獲。分別于花針期、結(jié)莢期、飽果期和成熟期取主莖倒3葉，快速置于液氮中，冷凍3～5 min 后置于低溫取樣盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存，以備測氮代謝酶活性。在花針期、結(jié)莢期、飽果期和成熟期取5株植株，將葉片、莖稈分開，烘干，研磨，保存，以備測蛋白質(zhì)含量;在果針入土后20、35、50、65 d，選取發(fā)育一致的莢果若干，烘干，去皮，磨碎，保存，以備測蛋白質(zhì)含量。

1.3 測定項(xiàng)目與測定方法

1.3.1 有關(guān)氮代謝酶活性的測定。

1.3.1.1 NR活性的測定。

采用陳薇等活體法[2]。將葉片去主葉脈，剪碎，稱取0.5 g左右，放入試管中，加入9 ml磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5），真空抽氣10 min，中間放氣2～4次，置于暗室反應(yīng)20 min，取出后加入反應(yīng)終止液濃度30%三氯乙酸1 ml，再取浸提液2 ml于試管中，分別加入濃度1%磺胺溶液和濃度0.02% α萘胺溶液各4 ml，振蕩搖勻后靜置35 min，然后在520 nm波長下比色測定吸光值。以NaNO2做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求NR活性。

1.3.1.2 GS、GDH、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的測定。

1.3.1.2.1 酶液提取。將葉片去主葉脈，剪碎，稱取0.5 g左右，放于研缽中，加入8 ml pH 7.6的TrisHCl提取液（包括1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L β巰基乙醇），分4次加入，冰浴研磨至勻漿，于4 ℃、15 000×g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液于試管中，置于0～4 ℃冰箱中備用。

1.3.1.2.2 GS測定。取0.5 ml酶液，加入1 ml反應(yīng)混合液（pH 8.0，80 μmol TrisHCl，40 μmol/L谷氨酸，8 μmol ATP，24 μmol MgSO4，16 μmol NH2OH），恒溫30 ℃，30 min，加入2 ml反應(yīng)終止液（2.5%（W/V）FeCl3，5%（W/V）三氯乙酸，1.5 mol/L HCl），3 000×g離心10 min，540 nm比色，以每分鐘形成1 μmol γ谷氨酰羥肟酸定義為一個(gè)GS活性單位。

1.3.1.2.3 GDH測定。取0.5 ml酶液，加入2.5 ml反應(yīng)混合液（0.3 ml 0.1 mol/L α酮戊二酸，0.3 ml 1 mol/L NH4Cl，0.2 ml 3 mmol/L NADH，1.7 ml 0.2 mol/L TrisHCl（pH 8.0）），在340 nm下每隔30 s讀數(shù)1次，共讀5次，以每分鐘吸光度的變化值表示酶活性。

1.3.1.2.4 GOGAT 測定。取0.2 ml酶液，加入2.8 ml反應(yīng)混合液（0.4 ml 20 mmol/L L谷氨酸，0.05 ml 0.1 mol/L α酮戊二酸，0.1 ml 10 mmol/L KCl，0.2 ml 3 mmol/L NADH，2.05 ml 25 mmol/L TrisHCl（pH 7.6），在340 nm下每隔30 s讀數(shù)1次，共讀5次，以每分鐘吸光度的變化值表示酶活性。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定。

采用微量凱氏定法（換算系數(shù)為5.46），稱取烘干、磨碎的花生葉片、莖稈0.5 g及籽仁0.10 g于消煮管內(nèi)，加入5 ml濃硫酸、0.5～1.0 g催化劑（CuSO4·5H2O∶K2SO4=1∶3），搖勻，蓋上彎形漏斗，在消煮爐上加熱，先低溫（110 ℃）1 h左右，待黑色泡沫不再上涌，升溫至250 ℃消煮，至管內(nèi)液體透明后取出，冷卻轉(zhuǎn)移至定氮儀專用大試管后定氮。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用最小顯著極差法（LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn);采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣肥不同用量對花生氮代謝酶活性的影響

2.1.1 NR活性。NR是農(nóng)作物氮素利用過程中的一種關(guān)鍵酶，其活性在一定程度上反映花生氮素同化及為蛋白質(zhì)積累提供氮源的能力。由圖1可知，施鈣在0.05水平顯著提高各時(shí)期NR活性，施鈣量為300 kg/hm2時(shí)效果最明顯，提高207.42%～52.95%。其活性與施鈣量的關(guān)系為：當(dāng)施鈣量為0～300 kg/hm2時(shí)，NR活性隨施鈣量的增加呈上升趨勢;當(dāng)施鈣量為300～450 kg/hm2時(shí)，隨施鈣量的增加有下降的趨勢。這表明施鈣利于花生氮素代謝，對提高供氮能力有利。

圖1 鈣肥不同用量對花生葉片NR活性的影響

2.1.2 GS、GOGAT和GDH活性。

GS是高等植物氮素代謝中十分重要的酶，與GOGAT聯(lián)合作用，催化氨的同化，為合成含氮有機(jī)物提供供體[3]。由圖2可知，施鈣在0.05水平顯著提高了花生各時(shí)期GS活性，當(dāng)施鈣量為300 kg/hm2時(shí)效果最明顯，提高72.81%～126.41%。其與施鈣量關(guān)系表現(xiàn)為：當(dāng)施鈣量為0～300 kg/hm2時(shí)，GS活性隨施鈣量的增多呈上升的趨勢;當(dāng)施鈣量為300～450 kg/hm2時(shí)，隨施鈣量的增加有下降的趨勢。

圖2 鈣肥不同用量對花生葉片GS活性的影響

由圖3可知，施鈣在0.05水平顯著提高了花生各時(shí)期GOGAT活性，施鈣量對其影響因生育時(shí)期而不同。在花針期和結(jié)莢期，當(dāng)施鈣量為300 kg/hm2時(shí)，GOGAT活性最大，分別提高43.49%、34.38%;在飽果期，當(dāng)施鈣量為150 kg/hm2時(shí)，其活性最大，提高48.52%，并且隨施鈣量的增加有下降的趨勢;在成熟期，GOGAT活性隨施鈣量的增加呈上升的趨勢，當(dāng)施鈣量為450 kg/hm2時(shí)其活性最大，提高36.94%。GS和GOGAT活性峰值均出現(xiàn)在結(jié)莢期，而結(jié)莢期是花生籽仁形成期，對籽仁中含氮有機(jī)物的合成有利。

圖3 鈣肥不同用量對花生葉片GOGAT活性的影響

在植物的衰老過程及逆境如高溫和水分脅迫等狀況下，GDH在氨的再同化中起重要作用，尤其是在發(fā)育后期，對催化合成谷氨酸具有重要的作用。由圖4可知，花生葉片中GDH活性在結(jié)莢期最小，成熟期達(dá)最大。施鈣在0.05水平顯著提高了各時(shí)期GDH活性，施鈣量對其影響因生育時(shí)期而不同。在花針期，GDH活性隨施鈣量的增加呈上升的趨勢，當(dāng)施鈣量為450 kg/hm2時(shí)活性最大，增加109.04%。在結(jié)莢期、飽果期和成熟期，當(dāng)施鈣量為300 kg/hm2時(shí)，酶活性最高，提高 31.11%～83.96%。

圖4 鈣肥不同用量對花生葉片GDH活性的影響

2.2 鈣肥不同用量對花生葉、莖和籽仁中蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5、6可知，隨著生育時(shí)期的推進(jìn)，花生葉片和莖稈中蛋白質(zhì)含量呈降低趨勢。施鈣增加了花生花針期、結(jié)莢期和飽果期葉片及莖稈中蛋白質(zhì)含量，降低了成熟期葉片及莖稈中蛋白質(zhì)含量。這可能是因?yàn)槭┾}提高花生生育前期對氮的吸收和積累能力，促進(jìn)花生生育后期氮籽仁中的轉(zhuǎn)移。這說明施鈣促進(jìn)了花生營養(yǎng)器官對氮的吸收和再分配，對籽仁中蛋白質(zhì)的合成有利。

圖5 鈣肥不同用量對花生葉片中蛋白質(zhì)含量的影響

圖6 鈣肥不同用量對花生莖稈中蛋白質(zhì)含量的影響

花生籽仁中蛋白質(zhì)含量是衡量花生品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖7可知，籽仁中蛋白質(zhì)從果針入土20 d開始迅速積累;果針入土50 d后，其含量變化不明顯。施鈣增加籽仁中蛋白質(zhì)含量，當(dāng)施鈣量為300 kg/hm2時(shí)效果最好，最終籽仁中蛋白質(zhì)含量增加達(dá)15.17%。它與施鈣量關(guān)系表現(xiàn)為，當(dāng)施鈣量為0～300 kg/hm2時(shí)，隨施鈣量的增加，蛋白質(zhì)含量呈上升的趨勢;當(dāng)施鈣量為300～450 kg/hm2時(shí)，隨施鈣量的增加，蛋白質(zhì)含量呈下降的趨勢。這說明施鈣利于籽仁中蛋白質(zhì)合成，對改善花生品質(zhì)有利。

圖7 鈣肥不同用量對花生籽仁中蛋白質(zhì)含量的影響

3 結(jié)論與討論

廖汝玉等[4]研究表明，鈣脅迫條件下培養(yǎng)枇杷小苗提高了葉片中NR活性，其影響因培養(yǎng)時(shí)間不同而不同。林春華等[5]研究表明，土壤中缺氮、磷、鉀、鈣均抑制花生葉片中硝

酸還原酶活性。在試驗(yàn)條件下，施鈣顯著提高了花生各時(shí)期NR活性，各處理間表現(xiàn)為Ca300gt; Ca450gt; Ca150gt;CK，表明合理施鈣利于氮素同化。

生利霞等[6]研究表明，施鈣顯著提高了櫻桃植株與氮代謝相關(guān)的NR、GS及GDH活性，處理間差異顯著。王志強(qiáng)等[7]研究表明，提高葉片中NR、GS等酶活性能夠促進(jìn)氮積累。該研究表明，施鈣顯著提高了花生各生育時(shí)期NR、GS、GOGAT和GDH活性，總體而言各處理間表現(xiàn)為Ca300gt; Ca450gt; Ca150gt;CK，處理間差異顯著。這說明增施鈣肥利于無機(jī)氮向有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，增加籽仁中蛋白質(zhì)積累，對提高氮素利用率有利。

楊小蘭等[8]研究表明，氮的吸收強(qiáng)度在花針期最高，之后減弱，在成熟期最低。余常軍等[9]研究表明，花生養(yǎng)分積累隨生育進(jìn)程而增加，到收獲期達(dá)最大值，每生產(chǎn)100 kg莢果需氮3.63 kg。在團(tuán)棵期后，花生營養(yǎng)元素主要從葉片、莖稈向莢果中轉(zhuǎn)移，根系分配變化較小。在該試驗(yàn)條件下，施鈣增加了花生葉片和莖稈中氮素的吸收、積累和再分配，提高了籽仁中蛋白質(zhì)含量，改善了花生籽仁品質(zhì)。

試驗(yàn)中，從花生各生育時(shí)期葉片中主要氮代謝酶活性和葉片、莖稈、籽仁中蛋白質(zhì)積累和分配規(guī)律等可以看出，施鈣顯著提高花生各生育時(shí)期主要氮代謝酶活性，促進(jìn)其對氮的吸收、積累和再分配，提高籽仁中蛋白質(zhì)含量，利于改善花生品質(zhì)。

42卷32期 " " " " " " " "王媛媛等 鈣肥不同用量對花生氮代謝的影響

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