摘要

[目的] 建立一種高效穩(wěn)定的雜種落葉松組織培養(yǎng)體系。[方法]以雜種落葉松成熟合子胚作為外植體材料，對(duì)其按照不同處理方式進(jìn)行消毒，且以不同種類培養(yǎng)基和激素種類及濃度進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，測(cè)算愈傷組織的體積。[結(jié)果]將去皮種子用流水沖洗2 d，用70%乙醇消毒1 min轉(zhuǎn)入4%NaClO消毒15 min后，再將剝出的胚放入0.5%NaClO消毒2 min胚存活率最高;在光照條件下，BM培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L TDZ愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，愈傷組織的誘導(dǎo)率為90.5%;愈傷組織的L、W、H與t呈類線性關(guān)系，體積與時(shí)間呈類指數(shù)關(guān)系。[結(jié)論] 為落葉松穩(wěn)定組織培養(yǎng)體系的構(gòu)建和優(yōu)化提供方法。

關(guān)鍵詞 "雜種落葉松; 成熟合子胚; 愈傷組織誘導(dǎo); 愈傷組織體積

中圖分類號(hào) S188 "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A "文章編號(hào) 0517-6611（2014）32-11243-04

The Culture Medium Establishment and Optimization for Callus Induction of Hybrid larch

ZHANG Li，ZHANG Lei*， FANG Jiaoyang et al

（Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract "[Objective] The aim was to establish a highly efficient and stable tissue culture system of Hybrid larch.[Method]Using mature zygotic embryos of Hybrid larch as explants material， different treatments for disinfection， and Callus induction were done in types "of different medium and hormone ， and the volume of callus was measured. [Result]Statistical analysis results showed that： the peeled seed washed with water for 2448 h， 70% alcohol disinfection for 1min into 4%NaClO for 15 min and then stripping out the embryo into 0.5% NaClO disinfection "for 2 min， survival rate of embryo was highest. ; In the light conditions， induced effect of cultured callus medium was best in BM by adding 2 mg/L TDZ， induction rate of the callus was 90.5%; callus long， width， thickness and time were linear relationship， was the exponential relationship between volume and time. [Conclusion] The study provided method for construction and optimization of "stability and tissue culture system of Hybrid larch.

Key words "Hybrid larch;Mature zygotic embryos;Callus induction;Volume of callus

落葉松是我國東北地區(qū)主要的針葉用材樹種，在林業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]，具有分布面積廣、適應(yīng)性強(qiáng)、生長迅速、耐寒能力強(qiáng)等特點(diǎn)。雜種落葉松（Hybrid larch）是落葉松屬中一個(gè)非常重要的速生樹種，其遺傳增益大，具有樹干通直、圓滿，木材堅(jiān)硬、耐腐蝕等特點(diǎn)，是鐵路、橋梁、造船、電業(yè)等方面的優(yōu)良用材[2]。但由于落葉松生長周期長，采用常規(guī)育種進(jìn)行新品種選育時(shí)，耗時(shí)長、見效慢，且某些優(yōu)良性狀在繁殖過程中無法控制，子代遺傳的效果差，同時(shí)還存在基因資源缺乏和雜交不親和等制約因素，落葉松組織培養(yǎng)不可控因素較多，且不同種落葉松無性繁殖差異性較大，所以需要建立一種高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系，而其中愈傷組織的誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)過程的第一步，也是比較重要的一步，通過穩(wěn)定的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的建立和優(yōu)化，可以為落葉松穩(wěn)定組織培養(yǎng)體系的構(gòu)建和優(yōu)化提供方法，也為無性系的繁殖、落葉松遺傳改良及轉(zhuǎn)基因育種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2013年采自黑龍江省牡丹江市林口縣青山種子園的成熟種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

外植體的消毒。選擇成熟、飽滿的雜種落葉松種子，剝?nèi)シN皮后，流水沖洗24～48 h。先使用70%的乙醇消毒1 min后，分別在4%NaClO消毒10、15、20 min，30% H2O2消毒15、20、30 min，或者0.1% HgCl2消毒6、8、10 min（HgCl2消毒時(shí)間過長時(shí)將胚殺死），然后無菌水洗凈，剝?nèi)ヅ呷?，將胚?.5% NaClO消毒2 "min，無菌水洗凈并用滅菌濾紙吸干水分，接種到培養(yǎng)基上，7 d后統(tǒng)計(jì)存活率（即非感染菌）。

1.2.2

基本培養(yǎng)基及激素組合、濃度的篩選。

以MS、S和BM為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L ，肌醇1 g/L ，L谷氨酰胺（LGln）450 mg/L，水解酪蛋白（CH） 500 mg/L，調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，MS、S置暗培養(yǎng)，BM光培養(yǎng)（暗培養(yǎng)效果差），按設(shè)計(jì)的激素組合及濃度（表2）分別添加至基本培養(yǎng)基中，置于23～25 ℃培養(yǎng)，觀察愈傷組織形態(tài)及生長狀況并統(tǒng)計(jì)愈傷率。

1.2.3

愈傷組織的長、寬、厚的測(cè)量及體積的計(jì)算。

在BM培養(yǎng)基，TDZ 2.0 mg/L的條件下，統(tǒng)計(jì)L、W、H。將接種日期記為第1天，每隔7 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量L、W、H，測(cè)12次，計(jì)算體積（mm3）。其中，1～ 3次按長方體計(jì)算體積V長，4～7次按圓錐體計(jì)算V錐，8～12次按球體計(jì)算V球，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。V的計(jì)算公式如下：

V長=L*W*H

V錐=（1/48）*3.14* L*（W+H）2

V球=（1/162）*3.14*（L+W+H）3

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)以試驗(yàn)中每一培養(yǎng)皿作基本單元分別統(tǒng)計(jì)，然后按處理方式的不同進(jìn)行分類，求得平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等，根據(jù)數(shù)據(jù)的情況進(jìn)行方差分析、多重比較、時(shí)序分析等。

2 "結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理的分析

NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒時(shí)間對(duì)胚存活率的影響見表1。由表1可知，9種不同處理方式中，以NaClO（4%）消毒15 min及HgCl2（0.1%）消毒10 min為佳，未染菌胚的存活率分別為88.9%和83.6%，標(biāo)準(zhǔn)差s分別為0.130 5和0.320 2。由于HgCl2的毒性較強(qiáng)并易污染環(huán)境，因此9種處理方式中以NaClO（4%）消毒15 min最佳。按滅菌劑的種類不同，得到的存活率依次為68.0%、49.0%和48.1%，標(biāo)準(zhǔn)差s依次為0.241 7、0.250 7和0.380 1。由此可知，NaClO的消毒效果顯著優(yōu)于H2O2和HgCl2。

表1 NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒時(shí)間對(duì)胚存活率的影響

滅菌劑

種類濃度

%處理時(shí)

間∥min外植體

總數(shù)∥個(gè)胚存活

數(shù)∥個(gè)胚存活

率∥%胚整體存

活率∥%

NaClO410563562.4 abc68.0 a

15807088.9 a

20643148.5 cd

H2O23015724359.3 bc49.0 b

20482859.0 bcd

30702231.4 de

HgCl20.1660813.3 e48.1 b

8643250.0 cd

10564783.6 ab

注：多重比較采用Duncan法，同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

表2 培養(yǎng)基和激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基激素組合及

濃度∥mg/L愈傷率

%愈傷組織的生長情況

MS0.5a+0.05b23.5白色，緊實(shí)，含水量大，生長慢

0.5a+0.5b31.4白色，緊實(shí)，生長較慢

0.5a+1.0b42.7白色、乳白色，疏松，生長一般

1.0a+0.05b44.3白色、乳白色，疏松，生長一般

1.0a+0.5b47.6黃白色、黃綠色，疏松，生長快

1.0a+1.0b40.9白色，疏松，生長一般

2.0a+0.05b48.1黃白色、黃綠色，疏松，生長快

2.0a+0.5b52.5黃白色、黃綠色，疏松，生長較快

2.0a+1.0b59.8黃白色、黃綠色，疏松，生長較快

0.05b+0.5c26.7白色，緊實(shí)，含水量大，生長慢

0.5b+0.5c32.8白色，緊實(shí)，生長慢

0.05b+1.0c39.5白色，緊實(shí)，生長一般

0.5b+1.0c45.2白色、乳白色，疏松，生長快

0.05b+2.0c33.1白色，緊實(shí)，生長慢

0.5b+2.0c31.9白色，緊實(shí)，生長慢

S0.5a+0.5b+0.5d17.6白色、黃白色，質(zhì)地硬，致密，生長慢

0.5a+0.5b+1.0d10.3含水量大，后期逐漸褐化死亡

0.5a+1.0b+0.5d15.8白色、黃白色，質(zhì)地硬，致密，生長慢

0.5a+1.0b+1.0d12.4白色，緊實(shí)，生長較慢

1.0a+0.5b+0.5d14.2白色，緊實(shí)，生長較慢

1.0a+0.5b+1.0d7.9含水量大，后期逐漸褐化死亡

1.0a+1.0b+0.5d16.8白色、黃白色，質(zhì)地硬，致密，生長慢

1.0a+1.0b+1.0d9.8含水量大，后期逐漸褐化死亡

2.0a+0.5b+0.5d18.3白色、黃白色，質(zhì)地硬，致密，生長慢

2.0a+0.5b+1.0d14.4白色，緊實(shí)，生長較慢

2.0a+1.0b+0.5d25.7黃白色，緊實(shí)，生長慢

2.0a+1.0b+1.0d20.2黃白色，緊實(shí)，生長慢

BM0.1b+0.5c40.6黃綠色、淺綠色，緊實(shí)，生長慢

1.0b+0.5c42.6淺綠色，致密，生長慢

2.0b+0.5c36.9黃綠色，致密，生長慢

0.1b+1.0c50.2綠色、黃綠色，疏松，生長快

1.0b+1.0c59.4綠色、黃綠色，疏松，生長快

2.0b+1.0c39.8黃綠色，致密，生長慢

0.1b+2.0c45.1淺綠色、黃綠色，致密，生長慢

1.0b+2.0c50.5綠色、黃綠色，疏松，生長快

2.0b+2.0c48.8淺綠色、黃綠色，致密，生長一般

1.0e55.6淺紫紅色、淺綠色，致密，生長一般

1.5e84.2紫紅色、綠色，疏松，生長較快

2.0e90.5紫紅色、綠色，色澤明亮，松散，生長快

2.5e41.1淺紫紅色、淺綠色，致密，生長慢

注：a，b，c，d，e依次代表2，4D，6BA，NAA，KT，TDZ。

2.2 基本培養(yǎng)基及激素組合、濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2.1

基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表2。由表2可知，MS培養(yǎng)基上的愈傷率為23.5%～59.8%，平均為40.0%，愈傷組織大多呈白色，生長速度一般;S培養(yǎng)基上的愈傷率為7.9%～25.7%，平均為15.3%，愈傷組織大多呈白色，生長速度慢，且更易褐化死亡;BM培養(yǎng)基上的愈傷率為36.9%～90.5%，平均為52.7%，愈傷組織呈綠色、黃綠色和紫紅色，生長速度較快。由此可知，BM培養(yǎng)基適合于雜種落葉松成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)，MS培養(yǎng)基次之。

2.2.2

激素組合、濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。激素組合、濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表2。由表2可知，MS培養(yǎng)基中主要包括2，4D+6BA與NAA+ 6BA 2種激素組合類型。當(dāng)2，4D與6BA組合使用時(shí)，愈傷率為23.5%～59.8%，平均43.4%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA組合為最佳，愈傷組織呈白色或黃白色，質(zhì)地疏松，生長速度一般（圖1）;當(dāng)添加激素為NAA與6BA組合時(shí)，愈傷率為26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA組合為最佳，愈傷組織呈白色，緊實(shí)，生長速度較慢（圖2）。

S培養(yǎng)基上，2，4D、6BA與KT 3種激素組合使用時(shí)，愈傷率為7.9%～25.7%，平均為15.3%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L KT組合為最佳，愈傷組織呈白色或黃白色，緊實(shí)，生長速度慢且一段時(shí)間后褐化死亡（圖3）。

BM培養(yǎng)基上有NAA+ 6BA與TDZ單獨(dú)使用2個(gè)處理。當(dāng)NAA與6BA組合使用時(shí)，愈傷率為36.9%～59.4%，平均46.0%，以1.0 mg/L NAA +1.0 mg/L 6BA組合為最佳，愈傷組織呈綠色、黃綠色，緊實(shí)，生長一般（圖4）;當(dāng)單獨(dú)使用TDZ時(shí)，愈傷率為44.1%～90.5%，平均67.9%，以2.0 "mg/L TDZ為最佳，愈傷組織呈紫紅色、綠色、黃綠色，疏松或緊實(shí)，生長較快（圖5）。

圖1 在MS上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA生長的愈傷組織

圖2 在MS上添加1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA生長的愈傷組織

圖3 在S上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L6BA+0.5 mg/LKT生長的愈傷組織

圖4 在BM上添加1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6BA生長的愈傷組織

圖5 在BM上添加2.0 "mg/L TDZ生長的愈傷組織

2.3 愈傷組織的量化與分析

愈傷組織的L、W、H及V隨時(shí)間t變化結(jié)果見表3。L、W、H與t基本符合線性正相關(guān)，且增長率隨t變化不明顯（圖6）。V與t在43 d之前基本呈線性正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)很小; 43 d后，V與t呈近指數(shù)關(guān)系，V隨t的增加而增大較快（圖7）。以BM+TDZ 2.0 mg/L上生長的愈傷組織作為統(tǒng)計(jì)對(duì)象，進(jìn)行愈傷組織L、W、H及V的時(shí)序分析，使得對(duì)愈傷組織生長狀況有一個(gè)量化的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)V與t進(jìn)行回歸擬合時(shí)，以V與t的立方關(guān)系為宜，擬合方程的F值為27.69，P值為0.001，Rsq（adi）值為99.5%，說明方程的擬合效果較好，且經(jīng)驗(yàn)證，當(dāng)t>40時(shí)，擬合方程較為準(zhǔn)確（圖8），擬合方程：

V=7.44+0.009t-0.101 1t2+0.003 49t3

表3 愈傷組織尺寸隨時(shí)間變化

試驗(yàn)天數(shù)

dL均值

mmW均值

mmH均值

mmV均值

mm3

01.720.960.631.06

72.191.310.922.68

142.701.861.306.56

213.673.182.838.99

284.343.493.1112.73

354.924.123.8721.18

426.095.344.5139.51

498.377.056.19198.70

569.738.057.35311.89

6311.609.438.62507.54

7012.8810.349.57686.74

7714.4012.0910.681 002.56

圖6 L，W，H的時(shí)間序列圖

圖7 V時(shí)間序列圖

圖8 V與t擬合線圖

42卷32期 " " " " " " " "張 莉等 雜種落葉松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的建立和優(yōu)化

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)過程中，獲得無菌的外植體是植物組織培養(yǎng)取得成功的最基本前提。落葉松成熟種子多帶有內(nèi)生菌，消毒非常困難，對(duì)種子表面消毒不能完全殺死內(nèi)生菌[3]。該試驗(yàn)以4%NaClO對(duì)去皮種子消毒處理15 min后，洗凈，剝?nèi)ヅ呷樵儆?.5%次氯酸鈉對(duì)胚消毒2 min，洗凈，胚的污染率最低，存活率達(dá)到88.9%，與王偉達(dá)等[3]研究結(jié)果相近，其利用2%NaClO消毒50 min后挑出胚直接接種，污染率高達(dá)91.1%，對(duì)去皮種子進(jìn)行消毒后，挑出胚放入0.5% NaClO中進(jìn)行浸泡，在不降低胚存活率的情況下明顯降低了污染率，胚存活率為78.8%，證明用低質(zhì)量濃度的NaClO對(duì)胚進(jìn)行浸泡處理的必要性。

愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為BM培養(yǎng)基，激素以2.0 mg/L TDZ單獨(dú)作用時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為90.5%，愈傷組織呈紫紅色、綠色，疏松或緊實(shí)，生長較快，該結(jié)論與激素促進(jìn)作用的倒鐘形曲線相符[4]，這為愈傷組織的分化、不定芽的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，在MS培養(yǎng)基上，當(dāng)2，4D與6BA組合使用時(shí)，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA組合為最佳，當(dāng)添加激素為NAA與 6BA組合時(shí)，愈傷率為26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA組合為最佳，該結(jié)論符合在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，生長素與細(xì)胞分裂素組合使用，當(dāng)生長素濃度高于細(xì)胞分裂素濃度時(shí)，能提高愈傷率的規(guī)律[5];S培養(yǎng)基上，2，4D、6BA與KT 3種激

素組合使用時(shí)，愈傷率為7.9%～25.7%，平均

15.3%，表明

S培養(yǎng)基不適合于雜種落葉松成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)，這與齊

力旺等[6]對(duì)華北落葉松未成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果不同;通過統(tǒng)計(jì)BM、S、MS 3種基本培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率、觀察愈傷組織生長狀況，表明高鹽濃度的培養(yǎng)基可能促進(jìn)愈傷組織數(shù)量及鮮重增加。

該研究通過對(duì)愈傷組織的L、W、H及V的時(shí)序分析，得到L、W、H、V與t正相關(guān)的結(jié)果，通過對(duì)線圖的觀察可以了解不同時(shí)間段的增長趨勢(shì)。V與t的回歸擬合，使得通過t來估算V成為可能，但目前由于跟蹤測(cè)量的次數(shù)較少使得該擬合方程是否能夠通過t來預(yù)測(cè)V還有待進(jìn)一步研究。

影響愈傷組織發(fā)生的因素包括基因型、采集時(shí)間或者合子胚的發(fā)育階段、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、碳源的濃度、凝膠物質(zhì)的濃度、肌醇等。盡管已有很多樹種誘導(dǎo)出愈傷組織，但大多仍顯示出相當(dāng)?shù)偷挠行в鷤T導(dǎo)率，一般在0～10%。因此，誘導(dǎo)出大量的有效愈傷組織，使其保持旺盛的分化狀態(tài)，是進(jìn)行后續(xù)以愈傷組織為基礎(chǔ)試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)[7]。

該試驗(yàn)以雜種落葉松成熟合子胚為材料，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，盡管該試驗(yàn)在誘導(dǎo)、繼代過程中都出現(xiàn)過褐化、死亡現(xiàn)象，但最終還是有部分生長旺盛且具胚性的愈傷組織能夠長期繼代增殖，這為愈傷組織的分化及不定芽的誘導(dǎo)提供了前提。

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