摘要 [目的]探索DNA條形碼技術(shù)在實蠅快速鑒定中的應用。[方法]利用DNA條形碼技術(shù)和BOLD系統(tǒng)，選取線粒體細胞色素氧化酶I（COI）基因片段，針對截獲入境旅客非法攜帶的番石榴中實蠅幼蟲進行序列測定、比對和分析，并對培養(yǎng)后的成蟲進行形態(tài)學分類從而驗證分子分類的結(jié)果。[結(jié)果]檢測的11頭實蠅幼蟲全部鑒定為橘小實蠅[Bactrocera dorsalis （Hendel） ]。[結(jié)論]為河北出入境檢疫部門初步探索DNA條形碼技術(shù)在實蠅快速鑒定中的應用及提升檢疫工作的時效性奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 實蠅;幼蟲;DNA條形碼;COI基因;分子鑒定

中圖分類號 S433.89 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11350-03

Molecular Identification of Fruit Fly Larvae from Intercept Entry Passenger Illegal Carrying Guava

LI Jing1， WANG Shen1， WANG Jianchang1* et al

（1. Technology Center of Hebei EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Shijiazhuang， Hebei 050051）

Abstract [Objective] The aim was to explore application of DNA barcoding technology in rapid identification of fruit fly. [Method] Based on the DNA barcoding and BOLD system， a series of studies， including sequencing， alignment and analysis， were conducted based on the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I （COI） gene using fruit fly larvae samples collected from intercept entry passengers illegal carrying guava. Adult morphological classification was carried out in order to verify the results of the molecular classification. [Result] All of the 11 larval specimens were Bactrocera dorsalis （Hendel）. [Conclusion] The results lay the basis for exploring application of DNA barcoding technology in rapid identification of fruit fly and promoting the timeliness of quarantine for Hebei entryexit inspection and quarantine departments.

Key words Fruit fly; Larvae; DNA barcoding; COI gene; Molecular identification

實蠅類昆蟲隸屬于雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritid），我國有400余種，其中絕大多數(shù)種類為水果、蔬菜和花卉作物的害蟲[1]。據(jù)統(tǒng)計，對農(nóng)業(yè)有重要經(jīng)濟意義的實蠅種類超過100種，還有150多種是次要或是潛在的害蟲。進入21世紀以來，隨著國際貿(mào)易活動的日趨頻繁和復雜化，實蠅類害蟲成為影響世界水果、蔬菜、花卉等進出口貿(mào)易的重要的檢疫問題，因此，實蠅的準確識別與快速鑒定受到世界各國的高度重視。

實蠅類害蟲多為國內(nèi)外檢疫對象，目前檢疫鑒定工作主要以完整成蟲的外部形態(tài)特征為依據(jù)[2]，幼體（包括卵、幼蟲、蛹）由于形態(tài)不穩(wěn)定或特征不明顯不能用于種類鑒定，而殘體更是無法用于種類識別。口岸截獲的往往是幼蟲、卵或蛹，亦或有頭、胸、足、翅等殘體的發(fā)現(xiàn)，對幼體一般是將其進行室內(nèi)飼養(yǎng)，待成蟲羽化后再進行鑒定[3]，而對殘體則無法進行準確鑒定。傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法耗時長，并且需要由專門從事實蠅分類的人員完成，所以無論是在室內(nèi)進行物種分類研究還是在口岸進行檢疫鑒定都受到限制。

隨著DNA檢測和分析技術(shù)的快速發(fā)展，目前各種分子生物學手段被廣泛應用于實蠅種類的鑒定，如RFLP、AFLP及DNA測序等[4]。DNA 條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）是一種新技術(shù)。其原理是利用基因組DNA 上一段標準的或者大家公認的基因片段作為分子靶標來進行種級水平的種類鑒定。用于條形碼的DNA 序列與整個基因組DNA 相比要短很多，而且非常容易獲得。線粒體CO I基因非常保守，在物種內(nèi)不同個體之間只有1%～2%的差異，而近緣種間的差異略大，非常適合作為DNA 條形碼技術(shù)的分子標記[5]。該技術(shù)可使非專業(yè)人員在很短時間內(nèi)準確、經(jīng)濟地對目標物種進行鑒定[6]，國際上加拿大科學家Paul Hebert于2003年第1個利用DNA 條形碼進行物種鑒定[7]，通過對線粒體COI基因5′端一段長度約為 650 bp 的標準基因片段進行測序和序列分析，進而在 DNA 水平上成功地區(qū)分物種[8]。

針對出入境植物檢疫領(lǐng)域的實際需求，筆者應用DNA條形碼技術(shù)對截獲臺灣番石榴果實中的實蠅幼蟲進行了COI基因片段序列檢測，將所獲序列與生命條形碼數(shù)據(jù)庫（Barcode of Life Data System v2.5：BOLD）中的實蠅標準序列進行相似性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，實現(xiàn)了實蠅幼蟲的分子鑒定，以期為河北出入境檢疫部門初步探索DNA條形碼技術(shù)在實蠅快速鑒定中的應用及提升檢疫工作的時效性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試實蠅幼蟲為河北出入境檢驗檢疫局石家莊機場辦事處截獲臺灣入境旅客攜帶的番石榴果實中剖檢收集得到，共計11頭，其中6頭用于DNA條形碼技術(shù)的鑒定，樣品浸泡于100%乙醇中低溫保存，剩余實蠅幼蟲在昆蟲培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)至成蟲。

以地中海實蠅和非洲芒果實蠅作為外群，并同時從GenBank中下載橘小實蠅和離腹寡毛實蠅屬中其他實蠅的COI基因片段（表1）進行比對分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。

實蠅幼蟲的DNA提取采用Genomic DNA Wizard 純化試劑盒（Promega公司）。參照試劑盒說明書進行基因組DNA的提取。

1.2.2 PCR擴增及測序。

1.2.2.1 DNA 擴增。

參考Folmer 1994年所使用的PCR擴增引物[9]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列：

LCO1490，5′GGTCAACAATCATAAAGATATTGG3′;HCO2198，5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′。

反應擴增體系為25.0 μl，包含2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl、20 μmol/L上、下游引物各1.0 μl、DNA 模板1.0 μl、ddH2O 9.5 μl。PCR反應程序：94 ℃ 預變性 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán);最后 72 ℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物保存于4 ℃，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析電泳結(jié)果。

表1 GenBank中下載的離腹寡毛實蠅和臘實蠅COI基因片段信息

物種登錄號物種登錄號

橘小實蠅

（Bactrocera dorsalis）JX266412南瓜實蠅

（Bactrocera tau）GQ154160

番石榴實蠅

（Bactrocera correcta）DQ116265地中海實蠅

（Ceratitis capitata）JQ668128

瓜實蠅

（Bactrocera cucurbitae）DQ116242非洲芒果實蠅

（Ceratitis cosyra）AY778421

1.2.2.2 PCR產(chǎn)物純化、測序及基因序列分析。

實蠅幼蟲DNA的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆到pGMT Vector，酶切鑒定插入片段正確的陽性克隆，分別隨機挑選3 個進行測序（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成），將獲得的實蠅幼蟲序列進行比較，然后在NCBI、BOLD 等公認數(shù)據(jù)庫進行相似性比對。利用Mega 5.0 軟件中的鄰接法（Neighborjoining，NJ）與數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的靶標實蠅種類的COI序列一同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并以地中海實蠅和非洲芒果實蠅為外圍種群，對各分支置信度（Bootstrap）進行1 000次以上的重復檢驗。最后，根據(jù)同源性分析數(shù)據(jù)和所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹確定鑒定結(jié)果。

1.2.3 成蟲形態(tài)學鑒定。

根據(jù)實蠅分類特征，在顯微鏡下完成實蠅成蟲的形態(tài)學鑒定。實蠅屬雙翅目實蠅科。實蠅科主要鑒定特征：Sc脈完整，與R1脈分離;該脈端段突然朝前彎曲成近90°;彎曲段變?nèi)?，終于前緣脈的斷裂處;或彎曲段消失。臀室具一尖角狀延伸[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，實蠅幼蟲均能擴增出658 bp的清晰條帶（圖1），其中第1～6泳道為實蠅幼蟲樣品。

圖1 實蠅幼蟲各樣品PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

2.2 實蠅幼蟲序列相似性比對鑒定

測序結(jié)果經(jīng)Chromas 軟件驗證圖譜為有效序列。6頭幼蟲樣品擴增片段長度均為658 bp，堿基相似度為100%。將所獲得的線粒體COI序列在GenBank中Blast結(jié)果顯示，與序列號為JX266412的橘小實蠅同源性為99.09%。使用Boldsystems v3檢索所獲得的幼蟲序列，所有樣品COI序列與編號為GBMIN 2114113橘小實蠅的標準序列相似性為99.68%。該研究獲得的線粒體COI片段的序列信息提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為KF696671。

2.3 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

以地中海實蠅和非洲芒果實蠅為外群，將得到的6頭實蠅幼蟲COI序列利用Mage 5.0軟件，采用鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示（圖2），聚集趨勢顯著，均和橘小實蠅聚為一支，能夠明顯與番石榴實蠅、瓜實蠅和南瓜實蠅區(qū)分開。表明同一物種個體能與其他物種的個體明顯區(qū)分，結(jié)果也驗證了分子鑒定的結(jié)論，DNA條形碼技術(shù)可對實蠅類幼蟲進行準確識別。

圖2 NJ法構(gòu)建的未知種及其相關(guān)種系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 實蠅成蟲形態(tài)學分類鑒定

對實蠅成蟲進行形態(tài)學鑒定（圖3），成蟲以黑色到暗褐色為主，或黑色與黃色相間。頭部黃色或黃褐色，中顏板具圓形黑色顏面斑1對。上側(cè)額鬃1對，下側(cè)額鬃2對;具內(nèi)頂鬃、外頂鬃和頰鬃;觸角顯長于顏面長，末端圓鈍。中胸背板黑褐色或黑色帶紅褐色區(qū);縫后側(cè)黃色條伸至翅內(nèi)鬃之后;肩胛、背側(cè)胛完全黃色;前翅上鬃、后翅上鬃、翅內(nèi)鬃和小盾鬃各1對，背中鬃確如;肩板鬃和背側(cè)鬃各2對。小盾片較扁平，黃色，基部具狹窄的暗色橫條。中背片黑色或中部淺黃色到橙褐色，兩側(cè)具暗色斑（圖3A）。翅前緣帶褐色，伸至翅尖，較狹窄，其寬度不超出R2+3脈;臀條褐色，不達后緣;bm室長是寬的1.8～1.9倍，其寬是cup室寬的2.5倍;cup室后端延伸段長，其長超過A1+CuA2脈段長（圖3B）。各足節(jié)不具暗色斑。腹部背板分離，黃色到橙褐色;第2腹背板前緣有黑色狹短橫條;第3～5節(jié)腹背板具黑褐色中縱條，該中縱條與第3腹背板褐色橫帶形成“T”形斑;第4腹背板的前側(cè)緣常有黑色斑紋;第5腹背板具腺斑（圖3C）。成蟲整體形態(tài)見圖3D。

以成蟲的形態(tài)學分類特征為依據(jù)，進行驗證，結(jié)果表明未知實蠅為橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）。

圖3 成蟲形態(tài)特征

3 討論

實蠅屬于全變態(tài)昆蟲，生長發(fā)育過程包括卵、幼蟲、蛹和成蟲4種蟲態(tài)。而實蠅類害蟲的鑒定一般以成蟲的形態(tài)特征為依據(jù)，而幼蟲的鑒定一直是一個分類難題。實蠅類害蟲的鑒定不僅需要依靠分類人員的經(jīng)驗積累，還要采取實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，費時費力。如果不能對外來有害生物及時鑒定種類，將對生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅。2003年Hebert提出了DNA條形碼的概念，該技術(shù)的出現(xiàn)為解決幼蟲的快速鑒定提供了技術(shù)理論支持和強有力的手段，如埃塞俄比亞學者利用COI分子標記技術(shù)對發(fā)生在甘蔗上的夜蛾屬幼蟲進行了鑒定[12];劉慎思等研究表明DNA條形碼技術(shù)可準確鑒定橘小實蠅幼體及成蟲殘體，證明該技術(shù)不限制于傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定[13]。

該研究利用DNA條形碼技術(shù)進行了橘小實蠅幼蟲的分子鑒定，構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明截獲的實蠅幼蟲和GenBank中的橘小實蠅遺傳距離非常近，與近似種的遺傳距離相對很遠，物種鑒定結(jié)果具有較高的可信度和準確性。同時還對羽化后成蟲進行了形態(tài)學的鑒定復核，鑒定結(jié)果為橘小實蠅，與DNA條形碼技術(shù)鑒定結(jié)果完全一致。在實驗室條件下，橘小實蠅幼蟲期一般為4～7 d，蛹期8 d左右，同時需要經(jīng)驗豐富的專業(yè)技術(shù)人員進行形態(tài)學鑒定。通過DNA條形碼技術(shù)，從DNA提取、擴增、測序到序列比對僅用3 d時間，不僅克服了幼蟲或蛹期的限制，而且實現(xiàn)了橘小實蠅幼蟲的非專家鑒定。近年來，基于DNA條形碼技術(shù)建立的檢測鑒定方法已廣泛應用于實蠅幼蟲的鑒定和區(qū)分[14-16]。

一種昆蟲成為某一地區(qū)的新害蟲有多種原因，自然擴散、人員往來、經(jīng)貿(mào)活動都是導致害蟲侵入的重要途徑[17]，另外全球氣候、種植結(jié)構(gòu)等變化也常導致新害蟲的發(fā)生[18-19]。河北省是一個開放性大省，擁有1個國際空港和4個大型海港，同國外貿(mào)易頻繁。同時該省是一個農(nóng)業(yè)大省，其鮮梨出口量占據(jù)我國總出口量的45%，位于全國前列。目前尚未見河北省存在橘小實蠅的報道，該害蟲一旦進入該省，將對該省農(nóng)業(yè)特別是果蔬生產(chǎn)業(yè)造成不可估量的損失。加大進境旅客非法攜帶水果的查驗力度，縮短截獲實蠅的鑒

定周期，提高物種鑒定效率，并采取切實有效的防控措施，防止橘小實蠅入侵已成為河北口岸迫切的任務(wù)。

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