摘要 [目的]對一株產(chǎn)聚谷氨酸（γPGA）的枯草芽孢桿菌N2的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。[方法]采用單因素試驗和響應(yīng)面分析法結(jié)合的方法，對枯草芽孢桿菌N2的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。[結(jié)果]優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為蔗糖31.5 g/L，大豆蛋白胨4.0 g/L，L谷氨酸44.3 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，無水CaCl2 0.2 g/L，NaCl 3.0 g/L。優(yōu)化得到的最適發(fā)酵條件為：pH 7.5，裝液量30%，接種量7%，37 ℃發(fā)酵48 h，此時γPGA的產(chǎn)量最大可達18.7 g/L。[結(jié)論]為今后聚谷氨酸的性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 γPGA;液態(tài)發(fā)酵;條件優(yōu)化;響應(yīng)面法

中圖分類號 S188+.4 "文獻標識碼

A "文章編號 0517-6611（2014）32-11231-05

Research on Liquidstate Fermentation Condition of γpolyglutamic Acid

LIU Jie， WANG Jianlei， LIU Yanni， MOU Haijin* "（College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao， Shandong 266003）

Abstract "[Objective] To optimize the liquidstate fermentation conditions to improve the production of γPoly glutamic acid （γPGA） of an bacillus subtilis N2. [Method] Single factor experiments and response surface methodology （RSM） were used to optimize the cultivation conditions and medium. [Result] Under the liquidstate fermentation， the optimum medium was sucrose 31.5 g/L， soy peptone 4.0 g/L， L glutamic acid 44.4 g/L， potassium dihydrogen phosphate 0.3 g/L， calcium chloride anhydrous 0.2 g/L and NaCl 3.0 g/L. The optimized cultivation conditions were decided as follows： initial pH value 7.5， medium volume 30%， inoculums size 7 % and temperature 37 ℃. The maximum yield of γPGA was 18.7 g/L after 48 h under the optimum conditions. [Conclusion] This paper finds the best combination of factors to promote the production of γPGA and contributes to the further research of γPGA.

Key words "γPGA; Liquidstate fermentation; Condition optimization; RSM

聚谷氨酸（Polygammaglutamic，γPGA） 是一種天然的水溶性酰胺化合物[1]，由L谷氨酸或D谷氨酸通過γ酰胺鍵連接而形成的多聚體[2]，由枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的γPGA結(jié)構(gòu)式見圖1[3] 。

圖1 γPGA的結(jié)構(gòu)式

1913年，γPGA被證實是一些芽孢桿菌莢膜結(jié)構(gòu)的主要成分，自1942年，Bovamick 等發(fā)現(xiàn)γPGA作為種發(fā)酵產(chǎn)物能自由地分泌到枯草芽孢桿菌的生長培養(yǎng)基中后，多種可在胞外產(chǎn)生γPGA的芽孢桿菌被發(fā)現(xiàn)[4] 。

γPGA具有生物可降解性、可食用性、對人體和環(huán)境無毒無害性等特性，因此γPGA及其衍生物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)等方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。目前γPGA生產(chǎn)方法主要有化學合成法、提取法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物合成法4種。前3種方法工藝復雜，成本較高，難以在實際生產(chǎn)中加以應(yīng)用[5]。相比之下，微生物合成法生產(chǎn)γPGA由于其工藝簡單且環(huán)境污染少等特點是目前最常用的方法。筆者通過單因素和響應(yīng)面分析法，得出了枯草芽孢桿菌N2的最佳培養(yǎng)條件，顯著提高了液態(tài)發(fā)酵過程中的γPGA產(chǎn)量，為以后γPGA的特性研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 枯草芽孢桿菌N2（Bacillus subtilis N2），由中國海洋大學應(yīng)用微生物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。初始培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，谷氨酸30.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L。初始培養(yǎng)條件：初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)基裝液量40%，接種量5%，發(fā)酵時間48 h。

1.2.2 指標測定方法。γPGA的產(chǎn)量測定參照文獻[6]，首先將發(fā)酵液的pH調(diào)至3降低發(fā)酵液黏度，之后4 800 r/min離心15 min去除菌體，上清液加入2倍體積的95%乙醇沉淀，4 ℃放置24 h后離心取沉淀，60 ℃烘干稱量。多糖采用苯酚-硫酸法測定[7]。黏度使用NDJ8S黏度計進行測定。

1.3 培養(yǎng)基組分的單因素試驗設(shè)計

主要考察不同碳源、氮源及其濃度、L谷氨酸濃度、金屬離子種類及濃度對γPGA產(chǎn)量的影響。

1.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

1.4.1 PlackettBurman 設(shè)計。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，采用Minitab 15.0 軟件中N=6的PlackettBurman設(shè)計對培養(yǎng)基中的蔗糖、大豆蛋白胨、L谷氨酸、KH2PO4 、無水CaCl2和NaCl這6種不同組分的重要性進行考察，以γPGA（g/L）產(chǎn)量作為響應(yīng)值，各因素水平見表1。

1.4.2 最陡爬坡試驗設(shè)計。

根據(jù)PlackettBurman試驗設(shè)計的結(jié)果進行主效應(yīng)分析。以各顯著因素的正負效應(yīng)確定試驗的最陡爬坡路徑以快速逼近最佳區(qū)域。γPGA產(chǎn)量（g/L）最高的處理，即為響應(yīng)面分析的中心點。

表1 PlackettBurman試驗各因素水平

因素

g/L編碼代號水平-1+1

蔗糖X110.050.0

大豆蛋白胨X21.06.0

L-谷氨酸X310.050.0

KH2PO4X40.10.5

無水CaCl2X50.10.5

NaClX604.0

1.4.3 響應(yīng)面分析。PlaekettBurman試驗確定了影響γPGA產(chǎn)量的主要因素，最陡爬坡試驗確定接近響應(yīng)值區(qū)域顯著因素的濃度，利用DesignExpert 8.0 軟件進行BoxBehnken的中心組合試驗設(shè)計，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對γPGA的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，以γPGA產(chǎn)量（ g/L）為響應(yīng)值，試驗設(shè)計見表2。

表2 BoxBenhnken試驗因素水平

因素

g/L水平-10+1

蔗糖25.03035.0

L谷氨酸35.04045.0

NaCl2.533.5

1.5 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

主要考察不同發(fā)酵條件對γPGA產(chǎn)量的影響，發(fā)酵條件主要包括培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度、裝液量和接種量，其各因素水平見表3。

表3 發(fā)酵條件因素與水平

水平因素

初始pH溫度∥℃裝液量∥%接種量∥%

16.028103

26.532205

37.037307

47.541409

58.0-50-

1.6 液態(tài)發(fā)酵過程中γPGA產(chǎn)量與黏度關(guān)系曲線 在優(yōu)化過的培養(yǎng)基中接種一定量的種子液，按照優(yōu)化得到的發(fā)酵條件進行發(fā)酵，連續(xù)測定發(fā)酵過程中的γPGA產(chǎn)量和黏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源的選擇。

由圖2可知，相比于其他碳源，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中γPGA的產(chǎn)量最高，其次為葡萄糖，效果最差的為檸檬酸。GOTO等[8]發(fā)現(xiàn)以檸檬酸為碳源能夠獲得較高產(chǎn)量的γPGA，與該試驗結(jié)果存在很大差異，這可能是由于缺少糖合成循環(huán)過程中的某種酶所造成的。因此，選擇蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖2 不同碳源對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.2 氮源的選擇。

氮源可分為有機氮源和無機氮源兩大類，由圖3可知，該枯草芽孢桿菌N2對有機氮源的利用明顯優(yōu)于無機氮源，且有機氮源中對大豆蛋白胨的利用率最佳。其他研究結(jié)果也存在對無機氮源利用率較好的枯草芽孢桿菌，如以NH4Cl作為Bacillus subtilis TAM4發(fā)酵的氮源，其γPGA產(chǎn)量為22.1 g/L[9]。在后續(xù)試驗中選用大豆蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖3 不同氮源對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.3 蔗糖濃度的選擇。

由圖4可知，隨著蔗糖濃度的升高，γPGA的產(chǎn)量增加，而蔗糖的轉(zhuǎn)化率隨之變小。當蔗糖濃度小于30.0 g/L時，雖然蔗糖轉(zhuǎn)化率大于80%，但γPGA的產(chǎn)量較低;當蔗糖濃度大于30.0 g/L時，蔗糖的轉(zhuǎn)化率接近或小于50%，蔗糖沒有充分利用。因此選擇蔗糖濃度為30.0 g/L，此時蔗糖的轉(zhuǎn)化率為72.6%，γPGA的產(chǎn)量為11.9 g/L。

圖4 蔗糖濃度對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.4 大豆蛋白胨濃度的選擇。

由圖5可知，隨著大豆蛋白胨濃度的增加，γPGA產(chǎn)量明顯增加，濃度達到4.0 g/L時，其產(chǎn)量達到最大值，隨著大豆蛋白胨濃度的進一步增加，γPGA的產(chǎn)量反而有所下降。因此，大豆蛋白胨的最佳濃度為4.0 g/L。

圖5 大豆蛋白胨濃度對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.5 L谷氨酸濃度的選擇。

有些菌體可以自身合成L谷氨酸，而有些菌體卻要通過攝取外界添加的L谷氨酸作為合成γPGA的前體物質(zhì)。由圖6可知，培養(yǎng)基中不添加L谷氨酸時也能夠生成γPGA，且濃度增加產(chǎn)量增大，但當L谷氨酸濃度到達40.0 g/L后再增加時，γPGA的產(chǎn)量雖然仍增加，但增加的量并不顯著，一定程度上造成L谷氨酸的浪費。同時發(fā)現(xiàn)γPGA產(chǎn)量的增加量與L谷氨酸的添加量不成正比，這表明添加的L谷氨酸并沒有全部用來合成γPGA，可能更多的是作為一種誘導物，促使枯草芽孢桿菌N2產(chǎn)生γPGA。因此選取L谷氨酸的濃度為40.0 g/L。

圖6 L谷氨酸濃度對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.6 金屬離子的選擇。

金屬離子可通過影響合成過程中酶的活性影響γPGA產(chǎn)量。原始培養(yǎng)基中包含有K+ 和 Mg2+，在只含有K+的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)得的γPGA產(chǎn)量為12.5 g/L，而在只含有Mg2+的培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的γPGA含量為3.3 g/L。這表明，K+是發(fā)酵生產(chǎn)γPGA的必需金屬離子。在只添加KH2PO4金屬鹽的基礎(chǔ)上，考察不同金屬離子對γPGA產(chǎn)量的影響。由圖7可知，含有Ca2+培養(yǎng)基的γPGA產(chǎn)量高于含其他金屬元素。因此選擇KH2PO4和無水CaCl2作為培養(yǎng)基的金屬鹽成分。

圖7 不同金屬鹽對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.7 KH2PO4和無水CaCl2濃度的選擇。

由圖8可知，隨著KH2PO4濃度的增大，γPGA的產(chǎn)量增加，在0.3 g/L時達到最大，KH2PO4濃度繼續(xù)增大，產(chǎn)量反而降低;無水CaCl2在0.2 g/L時產(chǎn)量值最大，高于或者低于該值，產(chǎn)量減小。因此選擇KH2PO4濃度0.3 g/L，無水CaCl2濃度0.2 g/L。

圖8 KH2PO4和無水CaCl2濃度對γPGA產(chǎn)量的影響

2.1.8 NaCl濃度的選擇。

隨著發(fā)酵的進行，γPGA產(chǎn)量增加致使發(fā)酵液的黏度逐漸增加，而過大的發(fā)酵液黏度不僅不利于菌體的生長還會影響供氧量，從而阻礙γPGA的產(chǎn)生和積累，添加適量的NaCl可以減緩發(fā)酵液黏度[10]。由圖9可知，當NaCl含量為3 g/L時，可有效提高γPGA產(chǎn)量。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 PlackettBurman試驗結(jié)果與分析。

以γPGA的產(chǎn)量（ g/L）作為響應(yīng)值，每組3個平行，發(fā)酵結(jié)果取平均值。PlackettBurman試驗結(jié)果見表4，用 Minitab15.0對各因素效應(yīng)及顯著性方差結(jié)果分析見表5。由表5可知，培養(yǎng)基組成中蔗糖、L谷氨酸、NaCl這3個因素對γPGA的產(chǎn)量有顯著影響，其中蔗糖、L谷氨酸為顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加，而NaCl 為顯著負效應(yīng)，應(yīng)減少。

2.2.2 最陡爬坡試驗。

根據(jù)這3個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進行最陡爬坡試驗，結(jié)果見表6，最優(yōu)發(fā)酵條件為處理②，故以處理②的條件為響應(yīng)面試驗的中心點，即蔗糖30.0 g/L，L谷氨酸40.0 g/L，NaCl 3.0 g/L。

2.2.3 響應(yīng)面分析與培養(yǎng)基最佳濃度的確定。

采用BoxBenhnken進行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗（圖10），以蔗糖（A）、L谷氨酸（B）、NaCl （C）為自變量，以γPGA的產(chǎn)量（g/L）為響應(yīng)值，根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果確定響應(yīng)中心和水平。試驗結(jié)果見表7。由表7可知， A、 B、AB、A2、C2對γPGA的產(chǎn)量影響顯著，說明蔗糖（A）、L谷氨酸（B）、NaCl（C）是γPGA合成過程中的重要因素，且蔗糖（A）與L谷氨酸（B）有一定的交互作用，引入二次多元回歸擬合。

表4 試驗設(shè)計及結(jié)果

處理X1X2X3X4X5X6γPGA的

產(chǎn)量∥g/L

①-1-1-1-1-1-15.84

②00000012.75

③00000012.76

④-1+1+1-1+1-115.77

⑤+1-1+1-1-1-116.55

⑥-1-1+1+1+1-113.24

⑦-1-1-1+1+1+15.55

⑧00000012.74

⑨+1+1-1+1+1-111.05

⑩+1-1+1+1-1+113.58

+1+1+1-1+1+113.70

-1+1-1-1-1+14.25

00000012.78

+1+1-1+1-1-18.56

+1-1-1-1+1+17.45

00000012.80

-1+1+1+1-1+19.05

表5 PlackettBurman 試驗各因素的主要效應(yīng)

編碼參數(shù)水平-1+1T值Prgt;t重要性

X1蔗糖10505.5901

X2大豆蛋白胨160.060.9576

X3L-谷氨酸105012.7502

X4KH2PO40.10.5-0.820.4325

X5無水CaCl20.10.52.910.0174

X6NaCl04-5.6702

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及其結(jié)果

處理蔗糖添

加量∥g/L L谷氨酸

添加量∥g/LNaCl添

加量∥g/LγPGA

產(chǎn)量∥g/L

①2030210.25

②3040316.58

③4050415.84

④5060515.78

利用DesignExpert 8.0 軟件對響應(yīng)面試驗得到的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到γPGA的產(chǎn)量與自變量A、B、C的二次回歸方程：

Y=16.05+2.19A +1.60B+0.45C-1.06AB-0.24AC-0.37 BC -0.29 A2-0.73 B2-2.13 C2

采用DesignExpert 8.0軟件進行方差分析，結(jié)果表明，P值為0.000 2，說明該方程顯著性較好，決定系數(shù)R2=92.58，

圖10 Y=f（B，C）（a），Y=f（A，C）（b） 和Y=f（A，B）（c）的響應(yīng)曲面

表7 "BoxBenhnken 試驗設(shè)計及結(jié)果

蔗糖添加量L谷氨酸

添加量NaCl添加量γPGA的

產(chǎn)量∥g/L

111113.87

20-1012.37

300017.02

400-112.38

51-1113.45

600017.91

711-113.98

800113.25

900015.80

10-1-1-15.55

111-1-112.48

12-11112.12

13-1-117.85

1400016.84

1510015.50

1600016.58

17-11-111.67

1800016.56

19-10010.21

2001016.05

說明試驗值與模型回歸值有較好的一致性，失擬項Pgt;0.05，說明該回歸方程能夠較好地反映實際情況，可用于分析和預(yù)測培養(yǎng)基組分對γPGA產(chǎn)量的影響。

經(jīng)過響應(yīng)面回歸方程，可以得出模型中最佳培養(yǎng)基組分：蔗糖31.5 g/L，大豆蛋白胨4.0 g/L，L谷氨酸 44.34 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，無水CaCl2 0.2 g/L，NaCl 3.005 g/L，在此條件下γPGA的預(yù)測值為17.076 "g/L。

2.3 培養(yǎng)基最佳濃度的確定和優(yōu)化驗證

為了驗證和確定回歸模型的適應(yīng)性，將培養(yǎng)基的濃度調(diào)整為蔗糖31.5 g/L，大豆蛋白胨4.0 g/L，L谷氨酸 44.3 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，無水CaCl2 0.2 g/L，NaCl 3.0 g/L進行發(fā)酵培養(yǎng)，此條件下γPGA產(chǎn)量為17.08 g/L，與預(yù)測產(chǎn)量有較好擬合性，由此證明該模型的可行性。

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)表3的發(fā)酵因素水平，對不同的初始pH、溫度、裝液量和接種量對發(fā)酵γPGA產(chǎn)量的影響進行單因素水平試驗。由圖11可知，在pH為7.5時γPGA的產(chǎn)量達到最高，說明在pH 7.5的條件下，不僅有利于菌體的生長繁殖，也有利于γPGA的積累;溫度37 ℃時有利于γPGA的合成，之后隨著溫度的升高γPGA產(chǎn)量開始出現(xiàn)逐漸下降的趨勢，說明過高的溫度反而會抑制γPGA的合成;裝液量通過影響培養(yǎng)基的溶氧量從而影響菌體的耗氧程度，最終影響γPGA產(chǎn)量，適當?shù)难b液量30%（75 ml/250 ml）既有利于菌體進行生長代謝，又利于γPGA的積累;接種量過低，菌體量過少降低γPGA的產(chǎn)量，反之，接種量過高，菌體密度增加相互抑制代謝，影響對原料的利用也造成γPGA產(chǎn)量的降低。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌N2發(fā)酵生產(chǎn)γPGA的最佳培養(yǎng)條件為pH 7.5，培養(yǎng)溫度為37 ℃，裝液量30%，接種量7%。

圖11 發(fā)酵條件對γPGA產(chǎn)量的影響

2.5 液態(tài)發(fā)酵過程中γPGA產(chǎn)量與黏度關(guān)系曲線

從圖12可知，當發(fā)酵2 d時，不僅γPGA的產(chǎn)量達到最大，發(fā)酵液黏度以及γPGA的黏度也均達到最大值。此后幾天γPGA的產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定而發(fā)酵液黏度和γPGA的黏度均呈下降趨勢，這與THORNE等[11]試驗過程中的現(xiàn)象一致。黏度的大小不僅與γPGA的產(chǎn)量有關(guān)，同時與分子量大小有關(guān)。該發(fā)酵進程曲線表明，隨著時間的增加，γPGA的分子量可能逐漸變小，說明后期發(fā)酵液中可能存在某種降解γPGA的酶。目前已有研究表明，合成γPGA的微生物中同時存在降解酶或其基因[12-15]。

圖12 γPGA的產(chǎn)量與黏度關(guān)系曲線

3 結(jié)論

由于γPGA具有的諸多優(yōu)良性質(zhì)和無毒無害等特點，使得γPGA擁有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。微生物發(fā)酵法是

目前使用最頻繁的途徑，通過單因素試驗響應(yīng)面法獲得了枯草芽孢桿菌N-2液態(tài)發(fā)酵γPGA的最適發(fā)酵條件，即發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖31.5 g/L，大豆蛋白胨4 g/L，L谷氨酸44.35 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，無水CaCl2 0.2 g/L，NaCl 3.005 g/L;發(fā)酵條件為：pH7.5，裝液量30%，接種量7%，37 ℃發(fā)酵48 h，該發(fā)酵條件能有效地提高γPGA的產(chǎn)量，使產(chǎn)量從最初的5.5 g/L提升到 18.7 g/L。枯草芽孢桿菌發(fā)酵獲得γPGA的平均分子量集中在100～1 000 kDa[16]，分子量過大則限制其應(yīng)用范圍。通過觀察發(fā)酵過程中黏度的變化情況對γPGA的分子量進行可控調(diào)節(jié)，對于生產(chǎn)不同分子量的γPGA以滿足不同條件的需求具有很好的工藝意義。該研究對枯草芽孢桿菌N-2產(chǎn)γPGA的發(fā)酵條件的優(yōu)化，為以后γPGA這種綠色功能性材料的性質(zhì)研究和推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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安徽農(nóng)業(yè)科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（32）：11236-11237，11249

責任編輯 李占東 責任校對 李巖