【摘 要】 目的 了解在T淋巴細(xì)胞中嵌合免疫受體的過繼性，為今后治療提供理論依據(jù)。方法 通過電穿孔方式，將四種嵌合免疫受體轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞，此時嵌合免疫受體中已經(jīng)將含有人源的單鏈抗體以及抗癌胚抗原。采用流式細(xì)胞儀了解其在T淋巴細(xì)胞中的形象以及狀態(tài)。結(jié)果 研究的4種嵌合免疫受體中有3種表達(dá)成功，其中CIR3在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)狀態(tài)最好，CIRZ未表達(dá)。結(jié)論 在T淋巴細(xì)胞中，嵌合免疫受體能夠有效表達(dá)，為今后實(shí)驗(yàn)方向打下了基礎(chǔ)，并為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 嵌合免疫受體；表達(dá)狀態(tài)；T淋巴細(xì)胞

【中圖分類號】 R730.51 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 B

通常而言，絕大多數(shù)TAA（腫瘤相關(guān)抗原）屬于自身抗原，在胸腺的耐受機(jī)制以及選擇機(jī)制下，研究對象機(jī)體面對由抗原引起的T淋巴細(xì)胞中多數(shù)受體都會表現(xiàn)出較低的親和力，因此會對其殺傷效果以及腫瘤識別造成影響。嵌合免疫受體指的是被克隆的、識別力強(qiáng)、親和力高的腫瘤抗原T淋巴細(xì)胞受體，簡稱為CIR。將嵌合免疫受體利用目前使用較多的基因傳染技術(shù)能夠讓T淋巴細(xì)胞感染，讓之前識別能力較低的T細(xì)胞能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞有效識別并且將之殺滅[1]。近年來隨著醫(yī)療水平的不斷上漲，嵌合免疫受體在基因工程的幫助下逐步能夠?qū)崿F(xiàn)對T淋巴細(xì)胞的活化基序識別以及對腫瘤抗原單鏈抗體的識別，同時還能夠以真核細(xì)胞為載體，將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染，使之達(dá)到識別腫瘤細(xì)胞并將其殺滅的目的[2]。本院基于這一情況，對嵌合免疫受體的四種形式在T淋巴細(xì)胞的表達(dá)展開分析，將高表達(dá)的CIR篩選出來，為今后實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本次研究使用的儀器為電穿孔儀、美國BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀、Sigma公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基。用于培養(yǎng)的血液由紅十字會血液中心無償提供。本次研究共研究了四種嵌合免疫受體，分別為CIR1、CIR2、CIR3以及CIRZ。

1.2 一般方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞分離 按照傳統(tǒng)方式將淋巴細(xì)胞分離。準(zhǔn)備AM-V培養(yǎng)基，其中需包含濃度為每毫升100毫克的鏈霉素、每毫升100U的青霉素以及10%的小牛血清，將人T淋巴細(xì)胞放入培養(yǎng)基中。將整個培養(yǎng)基環(huán)境控制在溫度37℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱里面[3]。培養(yǎng)液的更換頻率為兩天一次，同時需注意留取數(shù)對長期細(xì)胞作為備用。

1.2.2 轉(zhuǎn)染免疫受體 將制備好的四種嵌合免疫受體分別轉(zhuǎn)染到人T淋巴細(xì)胞之上，采用電穿孔方式轉(zhuǎn)染。根據(jù)產(chǎn)品使用說明，將電穿孔液（100μl）重懸T細(xì)胞后，將4μg的嵌合免疫受體加入其中。設(shè)定程序A23，在完成電穿孔程序之后將其放入已經(jīng)預(yù)熱完畢的培養(yǎng)液里。培養(yǎng)液同樣放在含有5%二氧化碳、溫度在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱里面[4]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 在轉(zhuǎn)染開始16小時之后，將其調(diào)整為每毫升1*106并放置在Eppendorf管里面。分別加入200μl FACS-PBS混合液以及濃度為每升400μg的CEA-APC中。將調(diào)配完成的培養(yǎng)管放在冰上約一小時，并且每隔15分鐘就采用顛倒方式將內(nèi)部液體均勻混合。采用PBS洗兩次之后，將其在500μl的FACS Fiow溶液中懸浮，此時可開始檢測[5]。

檢測使用的儀器為流式細(xì)胞儀，了解不同嵌合免疫受體在T細(xì)胞表面與含有人源化抗癌胚的抗原體之間結(jié)合狀態(tài)（定向結(jié)合情況）。對比物采用對不含有人源化抗癌胚的抗原體的空載體，同樣將其進(jìn)行電穿孔，以確保實(shí)驗(yàn)研究準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，研究的四種嵌合免疫受體中，CIRZ與用于對照的空載體相差并不大，其它三種均存在差異性，并與CEA-APC產(chǎn)生了定向結(jié)合，有效的在T細(xì)胞表面表達(dá)。這三組曲線均在某一階段高于對照空載體并呈現(xiàn)右移狀態(tài)。

對比CIR 1、CIR2與 CIR3，可發(fā)現(xiàn)CIR3的右移程度與曲線對比性最為明顯，其次依次為CIR2 與CIR 1，CIR Z沒有與CEA-APC結(jié)合。

3 討論

在基因工程以及分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展背景下，建立嵌合免疫受體并將其應(yīng)用到T淋巴細(xì)胞中已經(jīng)不再遙不可及，通過嵌合免疫受體，T淋巴細(xì)胞能夠充分發(fā)揮自身抗腫瘤能力。本次研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)的4種嵌合免疫受體在表達(dá)上僅有3種為有效表達(dá)，CIR3表達(dá)效果相對于其它兩種而言效果最好。相對于CIRZ而言，有效表達(dá)的三種受體在胞外端部分均存在鉸鏈區(qū)，因此推測這是其能夠在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)并在之后培養(yǎng)中與CEA產(chǎn)生結(jié)合的原因。

近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在信號傳導(dǎo)上單純使用CD3ζ鏈可能造成淋巴細(xì)胞由活化狀態(tài)凋亡。但在CD3ζ鏈與單鏈抗體之間加入例如CD28之類的共刺激分子時，能夠?qū)⒘馨图?xì)胞功能增強(qiáng)并減少其凋亡程度。本次試驗(yàn)將協(xié)同刺激分子與殺傷性抗腫瘤T細(xì)胞充分結(jié)合，讓細(xì)胞免疫聯(lián)合體液免疫，利用了信號傳導(dǎo)獨(dú)立性特征以及CD3ζ/TCR的抗原識別能力，聯(lián)合作用于T細(xì)胞活化的雙信號以及具有導(dǎo)向作用的抗體分子上，將T細(xì)胞活化閥值有效降低[6]。在這一試驗(yàn)作用下，T細(xì)胞殺傷力不再受到MHC限制，因此在臨床上應(yīng)用范圍更廣泛。由此可見免疫受體實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟诳鼓[瘤研究中發(fā)揮效用，提升腫瘤免疫治療有效性。

根據(jù)本次研究可以看出，通過抑制腫瘤細(xì)胞生長并將其殺滅能夠在注入特異性腫瘤T淋巴細(xì)胞方式下將腫瘤細(xì)胞消滅。臨床研究表明這種方式能夠?qū)⒛[瘤患者的腫瘤細(xì)胞從腫瘤組織、淋巴結(jié)或是外周血中有效分離。相信在更多嵌合免疫受體的構(gòu)建下，通過T淋巴細(xì)胞改善腫瘤治療效力的研究成果將不斷涌現(xiàn)。我院也會加大研究力度，在基因修飾作用下了解更多成功表達(dá)的嵌合免疫受體，為腫瘤治療提供更多理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 駱耐香，陳森洲.四種嵌合免疫受體在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)分析[J].中國老年學(xué)雜志，2010（12）：1695-1696.

[2] 徐雅娟.嵌合免疫受體在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥，2009（31）：62-63.

[3] 駱耐香，劉菁.嵌合免疫受體活性的體外檢測[J].中國免疫學(xué)雜志，2011（06）：511-513.

[4] 齊瑞兆.免疫受體在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].河北醫(yī)學(xué)，2011（01）：88-90.

[5] 張彩.天然免疫識別機(jī)制及天然免疫受體的相互調(diào)節(jié)[J].生物化學(xué)，2009（02）：124-128.

[6] 田志剛.NK細(xì)胞天然免疫受體與腫瘤免疫治療[J].中國藥理通訊，2013（02）：47-48.