【摘 要】DGGE 技術(shù)是由Fischer等于1979年提出的一種用于檢測DNA突變的電泳技術(shù)[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夾子”，使得突變檢出率大大提高，從而進(jìn)一步完善了該技術(shù)。1993年，Muyzer等將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物的生態(tài)學(xué)研究，并且證實了該技術(shù)在研究自然界微生物群落的種群差異性和遺傳多樣性方面具有突出的優(yōu)越性[2]。與傳統(tǒng)的菌種分離培養(yǎng)技術(shù)及生理生化指標(biāo)檢測相比，DGGE技術(shù)通過對微生物群落的核酸信息進(jìn)行分析，能更準(zhǔn)確、更快速的對菌群進(jìn)行鑒定，同時可鑒定出自然狀態(tài)下不可培養(yǎng)的菌株。由于DGGE技術(shù)具有重現(xiàn)性高、可靠性強(qiáng)和高效快捷等優(yōu)點[3]，現(xiàn)以用于微生物群落的復(fù)雜性分析、檢測微生物種群動態(tài)變化、對比細(xì)菌的富集培養(yǎng)及分離培養(yǎng)、單基因組中rRNA的多樣性分析、DNA提取方法比較等方面，在廢水、海洋、森林、土壤等環(huán)境樣品研究以及發(fā)酵工藝、植物內(nèi)生真菌研究、種群演替規(guī)律研究等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】DGGE；微生態(tài)；純培養(yǎng)

1.DGGE技術(shù)的原理

變性梯度凝膠電泳（DGGE）是根據(jù)小片段DNA分子（1kb以下）的熔解溫度不同來分析DNA分子的多樣性，理論上可以檢測到單個堿基替換的DNA分子。DNA片段在丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于自身的物理性狀，熔解狀態(tài)的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度比雙鏈DNA分子慢[4]。當(dāng)DNA片段處在變性劑濃度不斷增加的凝膠系統(tǒng)中，隨著電泳的遷移就會部分融化，達(dá)到一定變性劑濃度時DNA就會熔解為單鏈的分子，這些離散的碎片集中在一個比較狹窄的變形梯度范圍內(nèi)，這樣不同的DNA分子在不同變性劑濃度下熔解，在整個電泳圖譜中成樓梯式排列。通過對比熔解狀態(tài)下DNA片段的多態(tài)性，就可以推測有堿基突變或序列差異的DNA分子片段。

為了提高檢出率可在DNA一端加入一個高熔點區(qū)—GC夾（GC clamp）；GC夾就是在一側(cè)引物的5′端加上一個30～40bp的連續(xù)GC堿基，這樣在PCR產(chǎn)物的一側(cè)可產(chǎn)生一個GC夾的高熔點區(qū)，從而使相應(yīng)的部分序列處于低熔點區(qū)而便于檢測分析；這樣，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%[4]。

2.DGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

自然界中85%～99.9%的微生物是不可純培養(yǎng)的[5]，并且微生物的形態(tài)具有難觀測性和可變性，在傳統(tǒng)的實驗方法下不能提供足夠的微生物學(xué)信息，這嚴(yán)重阻礙了對自然環(huán)境中微生物構(gòu)成及特征的客觀認(rèn)識。PCR-DGGE 技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的一個最主要的應(yīng)用就是分析微生物群落構(gòu)成，Muyzer 等人于1993年首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物膜系統(tǒng)和生物菌苔的群落多樣性分析。此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種微生物生態(tài)系統(tǒng)的檢測，絕大部分研究都是通過擴(kuò)增原核生物 16S rDNA 基因來研究各生態(tài)系統(tǒng)中的古細(xì)菌或細(xì)菌的群落多樣性[6]，或者用真菌的通用引物擴(kuò)增18SrDNA 基因，從而研究真菌的群落多樣性，另外除了通過rDNA基因來分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成外，還可以通過擴(kuò)增功能性基因來研究功能基因及功能菌群的差異。

Lam等利用DGGE技術(shù)對真菌18SrDNA的序列進(jìn)行分析，研究Magnolia liliifera葉片中真菌的多樣性，結(jié)果在葉片的不同部位得到通過培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等對挪威紅杉?xì)堉颖局苯舆M(jìn)行DNA提取，利用DGGE分析通過FR1和NS1引物對擴(kuò)增的1650 bp rDNA片段，結(jié)果得到了46株木材腐爛真菌，為真菌群體中難培養(yǎng)的菌株的檢測提供了新的方法[8]。Zhou等對藏靈菇發(fā)酵液里的真菌和細(xì)菌的DNA進(jìn)行提取后，擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相應(yīng)片段，之后用DGGE進(jìn)行分析得到11株優(yōu)勢菌株，并且在不同樣本之間細(xì)菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。

PCR-DGGE 技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的另一個重要應(yīng)用是檢測微生物的動態(tài)變化。宋亞娜等運用16SrDNA和18S rDNA特異性引物對，將土壤中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過DGGE技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，研究不同間作和輪作種植體系對作物根際真菌和細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，間作明顯改變玉米的根際細(xì)菌、真菌的菌落結(jié)構(gòu)[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化學(xué)熏蒸后對散土和菠菜根部土壤中真菌群落的變化，結(jié)果表明，三氯硝基甲熏蒸兩個月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多樣性都減少，并且一年后真菌的多樣性并沒有完全恢復(fù)到原來的水平，但是菠菜根部土壤中真菌減少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯處理兩個月后，真菌的多樣性只發(fā)生微小的改變，并且六個月后就與對照組沒有顯著差異了[11]。

PCR-DGGE技術(shù)還可用于發(fā)現(xiàn)新的微生物菌株。Santegoeds等通過DGGE分析細(xì)菌16SrRNA上的基因片段來檢測多次富集培養(yǎng)的菌藻系，得到了14條獨特的16SrRNA基因序列，其中有10個細(xì)菌株的基因是以前利用純培養(yǎng)手段及單純的分子技術(shù)方法均沒有發(fā)現(xiàn)的[12]。

3.DGGE技術(shù)的局限性及改進(jìn)方法

DGGE 技術(shù)作為一種分子生物學(xué)手段在研究微生物群落的動態(tài)行為和復(fù)雜性方面發(fā)揮著重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物學(xué)工具，但是作為一種分子水平上的技術(shù)，除了具有多數(shù)分子技術(shù)所固有的缺點之外（如PCR產(chǎn)物偏差等），本身也有一定的應(yīng)用局限性。

首先，利用DGGE分離的PCR產(chǎn)物一般要求DNA長度在200～ 700bp范圍內(nèi)[1]，超出該范圍DGGE的分辨率會下降，然而這些序列只能提供有限的系統(tǒng)發(fā)育信息，不利于判斷微生物所屬的系統(tǒng)類群。其次，DGGE通常顯示的是微生物群落中的優(yōu)勢種群，Muyzer研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)只能對菌體數(shù)量大于總菌量1%的菌群進(jìn)行分析[1]。再次，每種菌可能含有數(shù)目不等的rRNA基因[13]，則可能會導(dǎo)致群落中菌株數(shù)量被過多的估計從而夸大群落差異性和多態(tài)性。另外，如果選用的條件不是特別適宜就不能保證將每類DNA片段完全分開，這樣序列不同的DNA片段遷移到凝膠的同一位置，導(dǎo)致同一條帶中含有不同種類的細(xì)菌[14]。

對于DGGE存在的這些缺限我們可以通過各種手段加以改善，例如可以優(yōu)化電泳及PCR的條件從而減少誤差，并且在進(jìn)行DGGE之前通過軟件來分析檢測PCR過程中形成的嵌合體，另外，可以與其他技術(shù)方法相結(jié)合，如純培養(yǎng)、直接形態(tài)觀察、原位雜交、核酸探針檢測技術(shù)等，這樣不僅更客觀的從多方面反映環(huán)境中微生物的多樣性信息，還可以與其他方法相互補(bǔ)充，從而不斷提高分子微生物生態(tài)學(xué)的研究水平。DGGE技術(shù)與傳統(tǒng)方法或其它分子生物技術(shù)的結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)了人們對微生物生態(tài)的認(rèn)識；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，DGGE技術(shù)將會得到不斷的補(bǔ)充和完善，必將在微生物生態(tài)研究中發(fā)揮更大的作用。

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