摘要：目的：醫(yī)源性膽管狹窄已是老問(wèn)題，但當(dāng)前仍然具有重要意義，從國(guó)內(nèi)、外有關(guān)的大量文獻(xiàn)報(bào)道中可見(jiàn)一斑[1]。據(jù)美國(guó)的資料顯示，在一組160萬(wàn)例的腹腔鏡膽囊切除術(shù)中，膽管（肝外）損傷率為0.5%。生理性膽管損傷的膽道自我修復(fù)過(guò)程中涉及到多種信號(hào)通路，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)法尼酯受體X（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）可能對(duì)此信號(hào)通路具有阻斷作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討法尼酯X受體（FXR）在大鼠膽管損傷修復(fù)中的表達(dá)，通過(guò)大鼠膽管上皮FXR時(shí)間表達(dá)與血液中膽汁酸含量對(duì)比關(guān)系，闡明FXR在膽道修復(fù)中的作用。方法 用蛋白凝膠電泳法檢測(cè)FXR 在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管膽管組織中的表達(dá)。采用等級(jí)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；使用SPSS15.0 分析軟件包分析數(shù)據(jù)；P<0.05 為有顯著性差異。結(jié)果 FXR在大鼠損傷膽管中表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。FXR在膽管損傷修復(fù)的過(guò)程中呈陽(yáng)性表達(dá)，膽汁酸濃度越高，F(xiàn)XR在膽管中的表達(dá)越低，而且表達(dá)強(qiáng)度隨損傷后的時(shí)間延長(zhǎng)而減少。結(jié)論：FXR 可能是一個(gè)保護(hù)性受體之一，其表達(dá)上升可能是膽管損傷修復(fù)的機(jī)制的一部分。在膽道損傷中炎癥介質(zhì)的釋放可能抑制了其表達(dá)，通過(guò)激活其表達(dá)有望對(duì)加速膽管損傷的修復(fù)起到一定作用。

關(guān)鍵詞：膽道損傷；法尼酯受體X；修復(fù)

【中圖分類號(hào)】R575.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-8602（2014）11-0011-01

醫(yī)源性膽管損傷是膽囊切除術(shù)最嚴(yán)重的并發(fā)癥，早已為人們所熟知和警惕，但仍時(shí)有發(fā)生，此外胃大部切除術(shù)、肝切除術(shù)、肝破裂修補(bǔ)術(shù)時(shí)也可發(fā)生。術(shù)后突出表現(xiàn)為膽道瘢痕性孿縮和膽管狹窄，膽道損傷后的過(guò)渡修復(fù)可能是其產(chǎn)生的重要原因之一，其機(jī)制尚不明確。法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）屬于代謝性核受體的一個(gè)亞族，能調(diào)節(jié)多種FXR靶基因的表達(dá)。FXR在肝臟、腸、腎臟、腎上腺高表達(dá)，而在脂肪組織和心臟中低表達(dá)[2-3]。 作為一種關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，F(xiàn)XR有著比人們以往認(rèn)為的更廣泛的作用。最近有越來(lái)越多的研究證明法尼酯X受體與炎癥和膽汁淤積這兩大病理過(guò)程有著密切的聯(lián)系[4-5]。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)觀察FXR在大鼠膽道損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)情況，觀察其與血清膽汁酸含量的對(duì)比關(guān)系，明確FXR在膽道損傷后膽道修復(fù)過(guò)程中的作用，從而進(jìn)一步探討膽道損傷后的修復(fù)機(jī)制，為膽道損傷的正確治療及預(yù)防提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

選用健康wistar大鼠60只，雌雄不限，體重200g左右，通過(guò)手術(shù)建立膽總管導(dǎo)管動(dòng)物模型。將大鼠隨機(jī)分為3組，一組為假手術(shù)組，一組為生理鹽水灌注組，另外一組為過(guò)氧化氫灌注組。觀察給藥后1、3、7、14天損傷及修復(fù)期的膽管中FXR的表達(dá)情況及血清中總膽汁酸的含量。所有標(biāo)本采集血清后采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定膽汁酸含量，采用免疫電泳測(cè)定膽管上皮內(nèi)FXR蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)操作：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、麻醉：按照體重給予%戊巴比妥鈉腹腔注射，0.3ml/100g，10-15分鐘大鼠麻醉。固定，開(kāi)腹：大鼠后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，按照無(wú)菌手術(shù)操作切開(kāi)腹腔，暴露膽總管及十二指腸。假手術(shù)組僅完成開(kāi)腹手術(shù)，不做插管。以穿刺法將聚乙烯塑膠導(dǎo)管插入膽總管管腔，另一端與預(yù)先已插置于頸部的導(dǎo)管栓連接，再以縫線和快干膠固定。術(shù)后逐層縫合：生理鹽水組恒速灌流15min；過(guò)氧化氫組（300umol/L）灌流15min。術(shù)后處理：術(shù)后禁食水24小時(shí)，給予青霉素G（80000U）預(yù)防感染。

1.2.2 標(biāo)本收集

術(shù)后的大鼠，經(jīng)24小時(shí)喂養(yǎng)后，斷頭處死并取血5ml，開(kāi)腹取膽總管。血液樣本于冰上放置10min，隨后4℃，14000rpm離心15min，取上層血清樣本于-80℃凍存。組織樣本稱重，按樣本與裂解液比例1：3-3.5w/v（重量/體積）加入裂解液。一般為150-170mg：500ul。將組織放入預(yù)冷研缽充分短時(shí)研磨，同時(shí)加入50×Cocktail蛋白酶抑制劑。收集勻漿液于冰上靜止30min，期間利用超聲振蕩器于4℃振蕩三次，超聲3-4s/次，強(qiáng)度為最大強(qiáng)度的3/4.間隔10s，至溶液透明。隨后于4℃離心20min，14000rpm。收取上清液，分裝，-80℃凍存。

1.2.3 電泳

Western Blotting：提取組織/細(xì)胞蛋白質(zhì)，并測(cè)定蛋白含量。對(duì)細(xì)胞抽提液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并干燥。將硝酸纖維素膜至于平皿中，加入封閉液（脫脂奶粉），室溫輕輕震蕩2-3小時(shí)。加入I抗，4℃輕輕震蕩2小時(shí)，PBS洗3次。將膜轉(zhuǎn)入150mM NaCl， 50 mM Tris-HCl（PH7.5）的溶液中，室溫輕輕震蕩10分鐘；加入II抗，室溫輕輕震蕩1小時(shí)；取出纖維素膜，150mM NaCl， 50 mM Tris-HCl（PH7.5）溶液中洗3-5次。顯色，照像。

運(yùn)用圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶掃描，且分析條帶的光密度值。結(jié)果與內(nèi)參數(shù)據(jù)進(jìn)行倍比處理。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用等級(jí)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；使用SPSS15.0 分析軟件包分析數(shù)據(jù)；P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1、膽汁酸含量結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，提示膽道H2O2灌注造成膽道損傷，膽道中膽汁酸的濃度較假手術(shù)組及生理鹽水灌注的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管組中術(shù)后1d、3d、7d、14d血清中總膽汁酸的含量（見(jiàn)表1，圖1）

2.2、FXR表達(dá)量結(jié)果分析

FXR在術(shù)后各期表達(dá)均較強(qiáng)， 無(wú)顯著性差別， 與假手術(shù)組與生理鹽水組比較，F(xiàn)XR表達(dá)存在顯著性差異（均P <0.05）。在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管組中術(shù)后1d、3d、7d、14d膽管中FXR表達(dá)量（見(jiàn)圖2）

3、討論

膽管損傷自身修復(fù)的過(guò)程涉及到多種信號(hào)通路，其中IL-6/gpl30/STAT3信號(hào)通路就是比較典型的一個(gè)，而TGF-β1是與瘢痕形成關(guān)系最密切、最具代表性的生長(zhǎng)因子。近來(lái)有大量研究指出法尼酯X受體（FXR）與IL-6、TGF-β1、IL-1等炎性介質(zhì)的表達(dá)有一定關(guān)系。這為我們解決膽道損傷后狹窄的問(wèn)題提供了一個(gè)新思路。另外，已有研究表明膽汁酸激活FXR能夠促進(jìn)肝臟再生，抑制肝纖維化，那么對(duì)于同樣與膽汁酸密切相關(guān)的膽道組織的損傷后修復(fù)的過(guò)程中，F(xiàn)XR的表達(dá)情況會(huì)是怎樣呢？

生理濃度的初級(jí)膽汁酸如鵝脫氧膽酸（ chenodexycholic acid， CDCA）、膽酸能與FXR在體外結(jié)合，并可募集輔活化子與FXR 配體結(jié)合域的結(jié)合；且該類配體不能與其他核受體相結(jié)合； 而其他核受體的配體對(duì)FXR的活化也沒(méi)有影響。以上證據(jù)表明膽汁酸是作為配體與FXR結(jié)合的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：FXR在膽管損傷修復(fù)的過(guò)程中呈陽(yáng)性表達(dá)，膽汁酸濃度越高，F(xiàn)XR在膽管中的表達(dá)越低，而且表達(dá)強(qiáng)度隨損傷后的時(shí)間延長(zhǎng)而減少。膽汁酸的濃度影響了FXR在膽管中的表達(dá)，提示膽汁酸或膽汁酸中的某一成分抑制了FXR在膽管中的表達(dá)。

另有報(bào)道提示膽汁淤積引起的的炎癥可抑制FXR的表達(dá)和活性，F(xiàn)XR或FXR調(diào)解基因的缺失可導(dǎo)致膽汁淤積，最后FXR激動(dòng)劑可GW4060通過(guò)上調(diào)FRX可顯著減輕肝內(nèi)外膽汁淤積小鼠模型的肝損傷，減少肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制膽管增殖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膽道H2O2灌注造成膽道損傷，膽道中FXR的表達(dá)較假手術(shù)組及生理鹽水灌注的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示通過(guò)激活FXR的高表達(dá)，阻斷IL-6/gpl30/STAT3信號(hào)通路，可能抑制Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的合成，并加速ECM的分解，從而減輕膽管損傷后的瘢痕攣縮，減少膽道狹窄的發(fā)生。本研究提示FXR可能是一個(gè)保護(hù)性受體，在膽道損傷中膽汁酸及炎癥介質(zhì)可能抑制了其表達(dá)，激活其表達(dá)有望是膽管損傷修復(fù)的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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