摘要纖維素酶是糖苷水解酶的一種，它可以將纖維素物質水解成簡單糖，通過菌株發(fā)酵得到乙醇，可以解決農業(yè)、再生能源以及環(huán)境污染等問題。由于普通纖維素酶的低效率及高成本，很難將其大規(guī)模工業(yè)化應用。耐熱纖維素酶由于其耐熱性、高效率而成為現(xiàn)在纖維素酶研究的熱點。從耐熱纖維素酶的來源、耐熱機制、提高纖維素酶耐熱性的方法以及現(xiàn)在工業(yè)化應用情況等方面進行了討論，并對耐熱纖維素酶進一步的研究、發(fā)展?jié)摿M行了展望。

關鍵詞耐熱纖維素酶；耐熱機制；酶的來源；提高耐熱性；工業(yè)應用

中圖分類號S182文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00336-03

基金項目泰安市科技發(fā)展計劃（201340629）；泰山學院博士科研啟動金項目（Y012013001）。

作者簡介彭靜靜（1983- ），女，山東泰安人，講師，博士，從事微生物基因工程和代謝工程研究，Email：zjingjing1983@163.com。

收稿日期20131203纖維素是自然界中分布最廣和含量最多的一種結構多糖。植物每年通過光合作用能產生大量的纖維素類物質，各種植物殘體中都含有大量的纖維素，目前大部分用于燃燒或者廢棄，不但污染環(huán)境而且造成了很大的資源浪費。而與之相矛盾的卻是人類所面臨的能源問題越來越嚴重，因此纖維素的開發(fā)與轉化在這種情況下應運而生。而纖維素物質可水解成單糖進而發(fā)酵生成乙醇、氫氣等可再生能源。纖維素酶作為纖維素降解與轉化的關鍵，得到了人們的關注。耐熱性纖維素酶因其耐熱特性而具有減少雜菌的污染、加快反應速度、簡化生產過程等優(yōu)點，人們對耐熱纖維素酶的各個方面進行了廣泛深入的研究，且一直致力于開發(fā)應用，成為如今纖維素資源轉化、降解纖維素的重點內容[1]。

1耐熱纖維素酶的開發(fā)潛力

耐熱性纖維素酶因其耐熱性在生產中具有實用價值，可簡化生產過程，減少雜菌的污染，高溫下可加快降解速度，減少生產成本等[1-2]，目前對其的應用已初具規(guī)模。隨著經濟的發(fā)展，纖維素酶必將在食品、飼料、環(huán)境保護、工業(yè)生產等方面挖掘出更大的潛力。目前人們更加關注的是耐熱纖維素酶在纖維素轉化為乙醇方面的開發(fā)，因為人類急需達到可再生資源乙醇代替石油這一愿望。木質纖維的降解利用過程中，結晶態(tài)纖維素的水解是主要瓶頸。纖維素酶的研究在國內外已經有大量的成果積累。纖維素發(fā)酵獲得生物乙醇的研究受到了世界各國政府和研究機構的一直以來的高度關注，有著無可比擬的市場和工業(yè)潛力。

2耐熱纖維素酶的工業(yè)化應用現(xiàn)狀

2.1食品發(fā)酵工業(yè)食品發(fā)酵工業(yè)是耐熱纖維素酶現(xiàn)階段應用最廣泛的一個領域[3]。在進行酒精發(fā)酵時添加適合的耐熱纖維素酶可顯著提高酒精的出酒率及原料的利用率，源自于纖維素酶的β1，3和β1，4能幫助大麥發(fā)芽，縮短發(fā)酵時間，而且酒的口感醇香[4]。在淀粉制造時，加入的纖維素酶可起到協(xié)同作用，縮短生產時間，增加產率；用大豆生產蛋白質時加入纖維素酶，因消化細胞壁可促使脫去豆衣，加快浸泡效率，增加蛋白質的得率；在果汁加工和橄欖油的提取中， 可促進汁液的獲得和澄清；在罐頭生產中加入纖維素酶可提高透明度，且風味好；在醬油的釀造中，纖維素酶可促進大豆的細胞壁水解、細胞膜膨脹軟化，使包藏在細胞中的蛋白質等營養(yǎng)物質釋放，明顯提高了醬油質量、縮短了生產周期[5]。諸如此類的優(yōu)點使耐熱纖維素酶的應用早已擴展到醫(yī)藥、日用化工、煙草、廢水處理等行業(yè)。

2.2原料生產中的應用農副產品和城市廢料中的纖維素，通過纖維素酶轉化為葡萄糖和單細胞蛋白，對人類有著很大的利用價值。耐熱纖維素酶在罐頭生產、茶葉加工、海藻中提取瓊脂中作為原料加入，明顯提高了產品的品質[6]。

2.3飼料工業(yè)制備低纖維飼料時，耐熱纖維素酶能轉化粗飼料如麥秸、殘木、麥糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分粗纖維素轉化為單體糖、小分子蛋白、低脂肪等，降低飼料中粗纖維含量，把大分子降解為更易消化的小分子物質；其次，在制取飼料酶制劑、植物纖維原料降解中的作用也不容忽視。

2.4其他用途纖維素酶最成功、量最大的應用是在工業(yè)（首屬紡織業(yè)）上，諸如牛仔布的水洗整理（拋光處理）應用當屬典型。在醫(yī)藥方面，纖維素酶與淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶有一樣的功效，可作為消化劑使用（因人類每天有大量的纖維素攝入），有報道稱某些發(fā)達國家已有含纖維素酶的消化劑出售。在遺傳工程方面，纖維素酶可用來去除植物、微生物的細胞壁，進行不同物種間細胞融合以達到農作物、微生物雜交育種的目的，解決了遠源雜交不親和的難題。在環(huán)保方面，纖維素酶可加速日常生活產生的污物降解，或把纖維素酶添加入清洗劑（如餐洗凈、洗衣粉）中，亦可增加清洗劑的效果。在造紙業(yè)方面，用耐熱纖維素酶處理熱紙漿，進行毛邊處理，可提高紙的品質。其他很多方面的應用還有很多，不再一一列舉。

3耐熱纖維素酶的研究現(xiàn)狀

3.1耐熱纖維素酶的產生菌至今，研究者們對耐高溫纖維素酶產生菌進行了廣泛研究，實驗用菌大多來源于研究者們的自然篩選，如從溫泉、活火山口附近。或者經過人工選擇，將自然突變的耐高溫菌從自然界中選擇出來。人們對耐高溫纖維素酶產生菌進行了廣泛研究，純化的耐熱纖維素酶的微生物有：多節(jié)閃爍桿菌（Fervidobacterium nodosum）[7]，克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）[8]，極端嗜熱球古菌（Pyrococcus horikoshii）[9]，解纖維熱酸菌 （Acidothermus cellulolyticus）[10]，熱纖維素梭菌（Clostridium thermocellum）[11]，海洋紅嗜熱鹽菌（Rhodothermus marinus）[12]，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）[13]，枯草桿菌（Bacillus subtilis）[14]，海棲熱袍菌（Thermotoga maritime）[15]，新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）[16]，強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）[17]，嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）[18]，超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）[19]等。

3.2耐熱纖維素酶的特性不同的酶各有其不同的生理結構和酶活性質、條件，即使是同一種酶在不同的條件下也可能有不同的特性，至今被研究者們研究的酶很多，如極端嗜熱古菌產生的纖維素酶對CMC底物有活性，105 ℃和3.0分別是其最適反應溫度和pH。云南師范大學的課題組曾在2009年從云南大馬尖山土壤中篩選到一株耐熱纖維素酶產生菌D9，該菌適合在pH 6.0、70 ℃的條件下發(fā)酵，產生的纖維素酶最適反應溫度和pH分別為70 ℃和6.0，在65 ℃保溫1.1 h后殘余酶活力為96%。來源枯草桿菌的纖維素酶在75 ℃條件下保溫30 min殘存的酶活性還可以達到70%。從隱球酵母中純化的胞外纖維素酶主要是對CMC底物的水解作用，對不溶性底物如結晶纖維素的降解能力低于對CMC底物的降解。常州工學院的賀蕓從高溫堆肥中分離得到一株嗜熱脂肪芽孢桿菌，它能產生胞外纖維素酶，酶的最適反應溫度和pH分別是66 ℃和7.0；而云南大學微生物研究所課題組同樣從西雙版納溫泉水樣中分離到了嗜熱脂肪芽孢桿菌的CC22菌株產生的酶最適反應溫度和pH分別是75 ℃和7.2。來源嗜熱菌（Pyrococcus horikoshii）的內切葡聚糖酶具有很強的水解結晶纖維素的能力[1]。表1列舉了部分微生物來源的耐熱纖維素酶特性。

3.3環(huán)境因素對嗜熱酶熱穩(wěn)定性的影響大多數(shù)耐熱纖維素酶有其固有的熱穩(wěn)定性，而一些產耐熱纖維素酶菌胞內酶則通過細胞內環(huán)境（鹽離子濃度、底物、分子伴侶、壓力、輔酶）來提高酶的耐熱性。①離子影響。與其他離子相比，鉀離子、鈣離子、硫酸根離子、銨根離子、磷酸氫根離子通過影響水分子作用，和相鄰殘基形成離子鍵、配位鍵起到類似二硫鍵的橋接作用，從而穩(wěn)定酶分子的三維結構。其中鈣離子的總用是最明顯的，也是研究最多的：在鈣離子存在的條件下，幾乎一半以上的堿性蛋白酶能在65 ℃的條件下維持15 min。耐高溫中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性更加依賴于鈣離子。有位學者曾經的研究：從云南西雙版納分離篩選的菌號為HY69的耐熱菌株產生的含鈣蛋白酶特別耐熱，最適活性溫度為87 ℃，且81 ℃保溫3.1 h 仍保持64%的活性。如用透析法完全除去該酶中的鈣離子，81 ℃保溫11 min就完全喪失活性。②底物分子總用。某些底物分子也可以通過穩(wěn)定酶分子的活性位點來使其適應高溫環(huán)境。③分子伴侶。當環(huán)境溫度接近胞內酶的變性溫度時，分子伴侶通過重新折疊來保護耐熱纖維素酶的活性。④此外，應用超高壓（50 MPa以上）也可使酶結構緊湊，疏水作用更穩(wěn)定；輔酶和某些熱穩(wěn)定因子（甘油、乙二醇、環(huán)多磷酸鹽等）也是不可缺少的因素。熱穩(wěn)定因子的作用很大，最常見的如甘油、蔗糖及乙二醇溶液。不同的纖維素酶耐熱機制不同，存在明顯的復雜性，對某一特定的酶而言，不同的耐熱機制所起的作用也不同，有的耐熱機制單一，有的則是幾種因素共同作用的結果。這些因素也為增加纖維素酶的耐熱性提供了參考。

3.4耐熱纖維素酶酶活測定方法

3.4.1傳統(tǒng)纖維素酶測定方法。纖維素酶是由多種酶組成的，因各自的底物專一性及降解產物不同，故檢測方法也是視具體情況而定。大多數(shù)時候，應用較多的是測定纖維素酶系總的糖化能力，如挑選某高產菌株，此菌株能產生纖維素酶系，完全有能力獨自徹底降解纖維素?？梢岳玫姆椒ㄓ袨V紙酶活測定方法、熒光法。原理都是測定纖維素降解生成的小分子糖的量來表征活性。在科學試驗中，研究者們只會專門研究有一種酶活性的纖維素酶，故其酶活測定方法也是特定的方法，如發(fā)展起來的內切葡萄糖苷酶測定方法有羧甲基纖維素Na并結合DNS法顯色，測定還原糖的量來表征酶活。再如外切葡糖苷酶活的測定用的較多的是微晶纖維素酶活測定方法和棉花糖化法，也要結合DNS顯色法。而葡糖苷酶活測定卻是以水楊苷作底物，用4氨基安替比林顯色，結合分光光度法測定，也可用熒光法（利用熒光物質與降解底物結合后在測熒光度）。當然還有其他的方法，但都是利用化學反應而進行間接的估量，誤差是絕對的，還有待更先進的、直接、方便的方法研發(fā)出來[20]。

3.4.2傳感器檢測方法。生物傳感器是綜合了生命科學、信息科學、電子技術的交叉學科，生物傳感器誕生于1962年，全面展開是在20世紀80年代。30多年來，生物傳感器的類型與應用也越來越多，壓電生物傳感器（ piezoelectric biosensors）是個典型。它主要是利用壓電石英諧振器對質量的敏感性，通過監(jiān)測諧振器吸附待測物后頻率的變化來檢測待測物。其次，電化學酶傳感器也應用較多，主要由2部分組成：固定化酶膜和電極。固定化酶膜可以選擇性“識別”被檢測的物質，并且催化被“識別”出的物質發(fā)生化學反應，電極則把這一催化反應中底物或產物的變量轉換成電信號，進而通過儀表顯示出來。傳感器方便、快捷，但技術很不成熟，仍需繼續(xù)研發(fā)。

4小結與展望

纖維素酶具有非常廣泛的應用前景，纖維素酶不但在食品、發(fā)酵、紡織、飼料等工業(yè)方面有很大的應用潛力，還可應用于造紙、醫(yī)藥保健、石油開采、新型能源、環(huán)保以及用于洗滌劑等行業(yè)，耐熱纖維素酶由于其無可比擬的優(yōu)勢更受到人們的關注。目前只有少數(shù)發(fā)達國家擁有纖維素酶的生產及應用技術，產品的壟斷造成市場價格居高不下。國內生產廠家少、生產規(guī)模小，應用技術尚需進一步攻關，產品供應以進口為主，供需矛盾較大。通過傳統(tǒng)的篩選人工突變或自然突變的耐熱纖維素酶產生菌和基因工程技術改造基因可以較大幅度地提高纖維素酶的耐熱性，還可以通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和發(fā)酵過程工藝，如采用固體發(fā)酵來增加纖維素酶高溫下的穩(wěn)定性。這些方法雖取得了一定成效，但仍達不到工業(yè)要求。徹底地解決問題還需深入研究纖維素酶的結構與功能發(fā)揮的關系以及作用方式，進而對其進行有效改造，從根源上解決問題；或者通過篩選新的產極高溫纖維素酶菌種，發(fā)現(xiàn)具有開發(fā)潛力的新酶源，因其天然性穩(wěn)定性會更高?？傊w維素酶是目前多糖水解酶類中少數(shù)幾個尚有大量亟待解決問題的酶，卻是有著無可比擬的市場和工業(yè)潛力的酶。下一步的重點會在分子水平上進一步闡明纖維素酶的結構與功能，研究耐熱纖維素酶的基因表達與調控的關系；針對不同工業(yè)需要研制各自適用的耐熱纖維素酶；擴大現(xiàn)有耐熱纖維素酶的耐熱限度。同時，加大科學研究成果的實際應用也是必不可少的。

參考文獻

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