柳青 張端 賀亞龍 張景來

摘要[目的]研究啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻的可行性。[方法]利用啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻，研究不同廢水濃度下螺旋藻的生長狀況及其對廢水中氮、磷、有機質(zhì)的去除效率，以及在放大培養(yǎng)時螺旋藻的生物量、蛋白質(zhì)和脂肪含量。[結果]螺旋藻可在啤酒廢水中生存，且啤酒廢水有緩沖培養(yǎng)液pH增加的作用，能使螺旋藻更長時間處于適宜生存的狀態(tài)。50%啤酒廢水、50%Zarrouk培養(yǎng)液最適宜螺旋藻生長，且產(chǎn)量達到最大。同時，螺旋藻可對啤酒廢水產(chǎn)生凈化作用。螺旋藻對100%啤酒廢水中有機質(zhì)、總氮、總磷的去除效率分別可達55.95%、77.78%和42.62%。在最佳配比濃度條件下，放大培養(yǎng)的產(chǎn)藻量為0.794 g/L，蛋白質(zhì)和脂肪含量分別達到69.5%和8.11%。[結論]該研究可使污水凈化和螺旋藻利用相結合，達到環(huán)境與經(jīng)濟效益的統(tǒng)一。

關鍵詞螺旋藻；啤酒廢水；去除率；產(chǎn)藻量

中圖分類號X797文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00054-03

作者簡介柳青（1990- ），女，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向：資源經(jīng)濟學，Email：irisliuqing@163.com。

收稿日期20131212近些年，由于工業(yè)企業(yè)將大量富含高營養(yǎng)物質(zhì)的工業(yè)廢水排放到自然水體中，引發(fā)了嚴重的水體富營養(yǎng)化問題，赤潮、水華頻發(fā)。尋找一種經(jīng)濟有效處理工業(yè)廢水的方法是當務之急。該試驗試圖利用能在較高營養(yǎng)物質(zhì)及嚴苛的生存條件下生存并對廢水進行處理的螺旋藻，使污水凈化和利用相結合，達到環(huán)境與經(jīng)濟效益的統(tǒng)一。

螺旋藻是目前常用微藻（小球藻、綠藻、螺旋藻）中蛋白質(zhì)含量最高、營養(yǎng)最全面的藻種，它的蛋白質(zhì)含量高達60%～70%，是小球藻的1.5倍[1]。螺旋藻生長所需pH高（pH 9～11），一般雜菌難以在其培養(yǎng)液中生長，可采用直接接種進行培養(yǎng)[2]。啤酒廢水富含有機物質(zhì)和氮、磷等成分，其化學需氧量（COD）可達到10 000 mg/L以上，未經(jīng)處理直接排放會對環(huán)境造成嚴重污染，普通啤酒廢水處理的成本又很高。螺旋藻具有培養(yǎng)條件簡便、繁殖速度快、對環(huán)境適應性強以及高蛋白質(zhì)高脂肪含量等特點，如果可以大規(guī)模利用啤酒廢水養(yǎng)殖螺旋藻，將是一個低費用、高效益的處理廢水的方法，同時能夠為生物質(zhì)油的制造提供良好原料。筆者利用啤酒廠廢水培養(yǎng)螺旋藻，研究了不同廢水濃度下螺旋藻的生長狀況及其對廢水中氮、磷、有機質(zhì)的去除效率，以及在放大培養(yǎng)時螺旋藻的生物量、蛋白質(zhì)和脂肪含量。

1材料與方法

1.1試驗材料Zarrouk培養(yǎng)基：NaHCO316.80 g/L，NaCl 1.00 g/L，K2HP O40.50 g/L，NaNO3 2.50 g/L，K2SO4 1.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，CaCl2·2H2O 0.04 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，Na2EDTA 0.08 g/L[2]。A5溶液：H3BO3 2.86×10-3 g/L，MnCl2·4H2O 1.81×10-3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22×10-3 g/L，CuSO4·5H2O 0.079×10-3 g/L，MoO3 0.015×10-3 g/L。B6溶液：NH4VO3 22.9×10-6 g/L，NiSO4·7H2O 47.8×10-6 g/L，Co（NO3）2·6H2O 4.4×10-6 g/L，NaWO4 17.9×10-6 g/L，TiSO4 40.0×10-6 g/L。

1.2試驗方法試驗利用過濾（抽濾法）后的啤酒廢水和Zarrouk培養(yǎng)液按照不同配比混合培養(yǎng)：①按照啤酒廢水含量0%、25%、50%、75%、100%與Zarrouk試劑進行混合，每個濃度設計兩個平行樣本，總計10個試樣；②添加營養(yǎng)元素進行培養(yǎng)：用硝酸鹽代替氮元素，而鈣離子和鎂離子則由自來水直接提供；③用250 ml錐形瓶于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，光照強度2 000 xl，溫度30 ℃，每隔3 h晃動一次，光暗周期為12 h∶12 h。

1.3螺旋藻生物量該試驗使用鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），購自中國科學院武漢水生生物研究所。采用分光光度法測定螺旋藻生物量。在每天的相同時間利用分光光度計測定各螺旋藻樣品在560 nm波長處的吸光度，根據(jù)得到的吸光度在標準曲線上找到對應的螺旋藻濃度，以了解螺旋藻的生長情況。比增長速率（R）根據(jù)以下公式計算：R=ln（x2/x1）/（t2-t1）。式中， x1為初始時的藻現(xiàn)存量；x2為結束時的藻現(xiàn)存量；t1為測定x1的日期；t2為測定x2的日期。

1.4培養(yǎng)液分析測定項首先，對啤酒廢水水質(zhì)進行分析，主要目的是測定螺旋藻對啤酒廢水中以下指標的去除率，因此測定培養(yǎng)液在培養(yǎng)螺旋藻前后的總氮、總磷、COD以及pH的變化情況。培養(yǎng)液pH：利用pH快速測定儀測定5、10、15 d錐形瓶中藻液的pH以了解螺旋藻的生長環(huán)境?？偭椎臏y定：采用鉬酸銨分光光度法，利用721分光光度計測定5、10、15 d的培養(yǎng)液總磷?？偟臏y定：采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定5、10、15 d的培養(yǎng)液總氮。COD的測定：采用快速消解分光光度法，利用COD快速消解儀測定5、10、15 d的培養(yǎng)液COD。

然后，進行擴大培養(yǎng)。由不同濃度配比的混合液中螺旋藻的生長情況得到最佳配比，在大缸中進行相對大規(guī)模培養(yǎng)。最后對得到的產(chǎn)物進行分析，通過測定其蛋白質(zhì)、脂肪含量，了解螺旋藻的生長情況和未來合成生物質(zhì)油的潛力。由恒溫箱培養(yǎng)得到50%啤酒廢水和50%Zarrouk培養(yǎng)液的比例下，螺旋藻的生長效果最好。因此以該比例放大培養(yǎng)，采用30 L啤酒廢水和30 L Zarrouk培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，接種比例為1∶12.5，光照強度2 000 xl，溫度30 ℃，光暗周期為12 h∶12 h。在大缸中放置兩個恒溫加熱器和一個循環(huán)機以保持微藻的生長均勻。對培養(yǎng)所得的藻體進行處理，稱取干重。收集50 ml藻體于篩絹上，于60 ℃烘干至恒重，冷卻后稱量，計算產(chǎn)藻量。最后進行產(chǎn)物分析，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，利用索氏提取器提取脂肪進行測定。

2結果與分析

2.1恒溫箱培養(yǎng)

2.1.1生物量測定。對試驗獲得的干藻粉進行生物量測定。稱取干燥后的藻粉，配制成5 g/L的藻液，利用超聲波使干藻粉充分溶解，搖勻。精確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml藻液于10只比色管中，加蒸餾水至50 ml標線，搖勻。利用721分光光度計在560 nm處測定其吸光度，得到螺旋藻吸光值與藻細胞濃度的標準曲線。

分別配制0%、25%、50%、75%、100%的啤酒廢水-Zarrouk培養(yǎng)液，做平行試驗，以0A、0B、25A、25B、50A、50B、75A、75B、100A、100B標記（75A表示啤酒廢水含量為75%，Zarrouk培養(yǎng)液含量為25%的平行試驗1組）。每日測定其吸光度，并在標準曲線圖中找出對應的螺旋藻濃度，結果如表1所示。在15 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，螺旋藻濃度呈逐漸增加的趨勢。在接種初期，由于接種量較低、光強較強，細胞生長出于遲滯狀態(tài)。此后，細胞逐漸進入指數(shù)生長期，個體數(shù)量迅速增加，但在大約13 d后，生長速度變緩，進入了生長的穩(wěn)定期。

2.1.2培養(yǎng)液性質(zhì)測定。

2.1.2.1pH。由于pH的測定過程耗時較長，且每天的pH相差不大，整體變化情況比較穩(wěn)定，所以每5 d測定一次pH，利用pH快速測定儀進行測定。由表2可知，pH呈逐漸上升趨勢。因為隨著藻細胞濃度的增加，對無機碳的利用也隨之加強，pH呈現(xiàn)上升趨勢。隨著廢水濃度的增加，pH升高的趨勢變緩。由此可見，添加了啤酒廢水對培養(yǎng)液的pH起到緩沖作用，使之升高速度減慢，從而延長了適宜螺旋藻生長的時間。因此在培養(yǎng)液中適當添加廢水有助于螺旋藻的生長。

2.1.2.2總磷。利用鉬酸銨分光光度法測定總磷。用甲苯做萃取劑，萃取水樣中的單質(zhì)磷。萃取液經(jīng)溴酸鉀-溴化鉀溶液將單質(zhì)磷氧化成正磷酸鹽，在酸性條件下，正磷酸鹽與鉬酸銨反應生成的磷鉬雜多酸被還原劑氯化亞錫還原成藍色絡合物，其吸光度與單質(zhì)磷的含量成正比，用分光光度計測定其吸光度，計算單質(zhì)磷的含量。按照鉬酸銨分光光度法的步驟，繪制得到磷標準曲線。培養(yǎng)液中總磷濃度由0.962 mg/L下降到0.052 mg/L，去除率為42.62%，去除效果較好。

2.1.2.3總氮。采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定總氮。在60 ℃以上水溶液中，過硫酸鉀可分解產(chǎn)生硫酸氫鉀和原子態(tài)氧，而硫酸氫鉀在溶液中離解產(chǎn)生氫離子，故在氫氧化鈉的堿性介質(zhì)中可促使分解過程趨于完全。分解出的原子態(tài)氧在120～124 ℃條件下可使水樣中含氮化合物的氮元素轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，并且在該過程中有機物同時被氧化分解?？捎米贤夥止夤舛确ㄓ诓ㄩL220和275 nm處，分別測出吸光度A220及A275，按下式求出校正吸光度A：A=A220-2A275。按吸光度A值比較標準曲線并計算總氮（以NO3N計）含量。由于啤酒廢水原始含氮量較高，超過該方法的量程，故對原水進行了稀釋，根據(jù)工作曲線得到了相應的濃度數(shù)據(jù)。在恒溫箱培養(yǎng)之前以及培養(yǎng)5、10和15 d測定100%啤酒廢水的總氮含量分別為11.7、8.9、5.3和2.6 mg/L?？梢?，啤酒廢水總氮含量較高，達到了11.7 mg/L，而經(jīng)過螺旋藻的生長和繁殖，廢水經(jīng)過凈化，最終的總氮濃度達到了2.6 mg/L，大幅度的減少，去除率達到了77.78%。

2.1.2.4COD。采用重鉻酸鉀分光光度法測定COD。在一定條件下，經(jīng)重鉻酸鉀氧化處理，水樣中的溶解性物質(zhì)和懸浮物所消耗的重鉻酸鉀相應于氧的質(zhì)量濃度，1 mol重鉻酸鉀（1/6 K2Cr2O7 ）相當于 1 mol氧（1/2 O）。試樣中加入已知量的重鉻酸鉀溶液，在強硫酸介質(zhì)中，以硫酸銀作為催化劑，經(jīng)高溫消解后，用分光光度法測定COD值。在進行對COD去除效果的測定工作時，由于使用的是哈希PC MultiDirect分光光度計進行分析讀數(shù)，校準之后的標準曲線為y=1.395 9 x+11.593 8，R2=0.999 3，擬合度較高，表示替換藥品的方法可行。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)之前以及培養(yǎng)5、10、15 d測定培養(yǎng)液的COD含量分別為163.9、143.9、105.2和72.2 mg/L?？梢娬麄€培養(yǎng)周期，螺旋藻對COD的去除率為55.95%。通過用啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻，啤酒廢水中的有機物含量大幅下降。

2.2擴大培養(yǎng)

2.2.1產(chǎn)藻量的測定。抽取50 ml螺旋藻液，體積記為V，用500目的雙層篩絹進行過濾。過濾前稱量篩絹的質(zhì)量為72.381 9 g，記為m1，過濾之后在60 ℃下烘干篩絹與螺旋藻至恒重，取出待冷卻后，稱量其質(zhì)量，為72.421 6 g，記為m2。在50%啤酒廢水與50%Zarrouk培養(yǎng)基的條件下，螺旋藻的產(chǎn)藻量達到了0.794 g/L。即使沒有添加培養(yǎng)基的純污水也能培養(yǎng)并收獲一定量的螺旋藻。

2.2.2產(chǎn)物分析。

2.2.2.1蛋白質(zhì)含量。在各個不同配比的標準試樣中加入考馬斯亮藍G-250之后，顯色2 min以上，利用721分光光度計在595 nm波長處測定其吸光度，將第1組作為空白背景值扣除。根據(jù)蛋白質(zhì)含量不同對應著不同的吸光度值，可以做出蛋白質(zhì)標準曲線。樣品中蛋白質(zhì)含量的測定：利用500目的篩絹對螺旋藻液進行過濾，用清水反復沖洗至中性，過濾后將篩絹置于60 ℃恒溫箱中烘干至恒重。稱取0.1 g干藻粉，加入100 ml蒸餾水，在-20和37 ℃反復凍融3～4次。最后一次融化后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速在離心機里轉(zhuǎn)10 min，取上清液測量其蛋白質(zhì)含量。最后取0.1 ml的上清液，用蒸餾水稀釋至1 ml，加入5 ml G250試劑，顯色2 min以上，測其吸光度A=1.378。根據(jù)擬合曲線方程，求得測定的0.1 ml上清液中有蛋白質(zhì)m1=69.5 μg。X=m1/V2×V1/m=69.5/0.1×1/0.1×100%=69.5%。其中，X為干藻粉的蛋白質(zhì)含量，%；m1為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，μg；V1為上清液的總體積， ml；V2為提取上清液的體積， ml；m為干藻粉總重量，g。最終得到螺旋藻的蛋白質(zhì)含量為69.5%，相對較高。這說明利用啤酒廢水和Zarrouk培養(yǎng)基聯(lián)合培養(yǎng)的螺旋藻生長情況良好，蛋白質(zhì)含量在正常范圍之內(nèi)。

2.2.2.2脂肪含量。將樣品預先在乙醚溶劑中浸泡一定時間，使部分油脂在乙醚溶劑中浸出，再采用索氏提取法，以乙醚為溶劑，在60～80 ℃的溫度條件下進行脂肪抽提。利用脂肪能溶于有機溶劑的性質(zhì)，在索氏提取器中將樣品用無水乙醚或石油醚等溶劑反復萃取，提取樣品中的脂肪后，蒸去溶劑，所得的物質(zhì)即為脂肪或稱粗脂肪。X=（m1-m0）/m×100%=（112.690 1-112.527 9）/2×100%=8.11%。其中，X為樣品中粗脂肪的質(zhì)量分數(shù)，%；m1為脂肪和脂肪燒瓶的質(zhì)量，g；m0為脂肪燒瓶的質(zhì)量，g；m為樣品的質(zhì)量，g?？梢姡摯未蟾着囵B(yǎng)得到的螺旋藻的脂肪含量大約為8.11%，屬于螺旋藻脂肪含量的正常范圍。

3結論

（1）螺旋藻可以在經(jīng)過一定處理的啤酒廢水中生長，即使沒有添加任何營養(yǎng)成分也可以成活，能夠做到污水全培養(yǎng)。

（2）螺旋藻在50%啤酒廢水、50%培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)，比增長速率最大，生長量最高。

（3）啤酒廢水起到緩沖培養(yǎng)液pH增加的作用，能使螺旋藻更長時間處于適宜生存的狀態(tài)。

（4）螺旋藻對啤酒廢水的有機物、磷、氮有良好的去除效果，去除效率分別可達55.95%、42.62%、77.78%。