逯雯潔 林鵬程

摘要[目的]建立藏藥八味獐牙菜丸中鹽酸小檗堿含量的測定方法。[方法]采用反相高效液相色譜法測定，色譜柱為依利特Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25∶75，V/V）為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測波長為265 nm。[結(jié)果]在0.165 6～2.318 4 μg范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿濃度與峰面積線性關(guān)系良好，R=0.999 5，平均回收率為97.30%，RSD為1.57%（n=6）。[結(jié)論]該測定方法快速、重現(xiàn)性好，可用于八味獐牙菜丸中鹽酸小檗堿成分的含量測定。

關(guān)鍵詞HPLC；八味獐牙菜丸；鹽酸小檗堿

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00050-02

作者簡介逯雯潔（1985-），女，青海西寧人，藥師，碩士，從事中藏藥品分析檢驗(yàn)工作，Email：kathy_608@163.com。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事天然產(chǎn)物有效成分研究工作，Email：qhlpc@126.com。

收稿日期20131202八味獐牙菜丸為藏醫(yī)傳統(tǒng)名方，收載于1995年《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為：WS3-BC-0241-95）[1]，由獐牙菜（Swertia）、兔耳草（Short spike Lagotis）、波棱瓜子、角茴香（Root of Erect Hypecoum）、榜嘎、小檗皮、巖參、木香8味藏藥材組成，臨床上用于治療膽囊炎及初期黃疸型肝炎。處方中小檗皮為小檗科植物甘肅小檗（Berberis kansuensis Schneid.）的干燥皮，是常用藏藥材之一[2]?！毒е楸静荨酚涊d，小檗皮“性涼而糙，能斂毒，清黃水，可除毒病及黃水病，止瀉，并可除陳舊熱病、陳舊黃水病及一切眼病”。說明小檗皮為方中主要功效成分之一，而原部頒標(biāo)準(zhǔn)無含量測定項(xiàng)。為提高小檗皮的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜法對(duì)八味獐牙菜丸中的小檗皮建立含量測定方法，以期為八味獐牙菜丸的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。八味獐牙菜丸樣品由2家藥廠提供，分別是青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)20090722、20100420）和寧夏多維藥業(yè)有限公司（批號(hào)060601、080304、080911、090310、090311、091212、091209、090312）。

1.1.2 主要儀器。Waters1525型高效液相色譜儀和Waters2489紫外檢測器，均購自Waters公司；METTLER AB204-S電子天平和METTLER TOLEDO電子天平，均購自瑞士METTLER公司。

1.1.3 主要試劑。鹽酸小檗堿對(duì)照品（0713-200911），購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱為依利特Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25∶75，V/V）為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測波長為265 nm。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制。精密稱取8.28 mg鹽酸小檗堿對(duì)照品，加無水甲醇超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得，鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液濃度為0.331 2 mg/ml。

1.2.3 提取方法的選擇。精密稱取1.000 g八味獐牙菜丸（批號(hào)060601），置具塞錐形瓶中，精密加入25.0 ml鹽酸-無水甲醇（1∶100，V/V），稱定重量，分別采用回流和超聲提取，提取時(shí)間為30 min，在“1.2.1” 色譜條件下測定鹽酸小檗堿的含量，比較提取結(jié)果的優(yōu)劣。

1.2.4 提取時(shí)間的選擇。精密稱取1.000 g八味獐牙菜丸（批號(hào)060601），置具塞錐形瓶中，精密加入25.0 ml鹽酸-無水甲醇（1∶100，V/V），超聲提?。üβ?50 W，頻率50 kHz）20、30和40 min，在“1.2.1” 色譜條件下測定鹽酸小檗堿的含量，比較提取結(jié)果的優(yōu)劣。

1.2.5 陰性對(duì)照溶液的配制。按處方比例稱取除小檗皮外的其他藥材適量，依據(jù)八味獐牙菜丸的處方工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

1.2.6 方法學(xué)考察。（1）系統(tǒng)適應(yīng)性考察。取適量對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，在“1.2.1” 色譜條件下測定鹽酸小檗堿的含量，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。（2）線性關(guān)系的考察。按上述色譜條件，分別精密吸取0.5、0.7、1.0、3.0、5.0和7.0 μl對(duì)照品溶液（0.331 2 mg/ml），在“1.2.1” 色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積y為縱坐標(biāo)，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。（3）精密度考察。精密吸取3 μl濃度為0.331 2 mg/ml對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算RSD。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取供試品溶液（批號(hào)060601），按上述色譜條件分別在0、2、4、6和8 h注入液相色譜儀，進(jìn)樣量3 μl，測定鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算RSD。（5）重現(xiàn)性試驗(yàn)。取樣品（批號(hào)060601）制備5份供試液，按上述色譜條件下分別測定，進(jìn)樣10 μl，測定峰面積，按鹽酸小檗堿峰面積計(jì)算RSD。（6）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加無水甲醇溶解配制成0.331 2 mg/ml的溶液，搖勻；精密稱取0.400 g已知含量的八味獐牙菜丸樣品（批號(hào)060601，含量為2.553 mg/g），稱取6份，置具塞錐形瓶中；每份中均同時(shí)加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（0.331 2 mg/ml）2.0 ml，并精密加入鹽酸-無水甲醇（1∶100，V/V）23 ml，制成供試品溶液，并按色譜條件測定鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.7 樣品溶液的含量測定。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，按上述色譜條件對(duì)10批樣品進(jìn)行含量測定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿的含量。

2結(jié)果與分析

2.1提取方法的選擇 測定結(jié)果表明，回流提取法和超聲提取法的提取結(jié)果差別不大，因回流提取繁瑣費(fèi)時(shí)，故選擇超聲提取法。

2.2提取時(shí)間的選擇 測定結(jié)果表明，30和40 min所測得的芒果苷含量接近，且大于20 min所提的含量，故提取時(shí)間選擇30 min。

2.3方法學(xué)考察 （1）系統(tǒng)適應(yīng)性考察。圖1表明，在相同時(shí)間上，對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液圖譜有對(duì)應(yīng)的吸收峰，陰性無干擾，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。（2）線性關(guān)系的考察。計(jì)算得線性回歸方程為y=4 629 102.46x-136 034.70，R=0.999 5。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.165 6～2.318 4 μg/ml范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。（3）精密度考察。計(jì)算得鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.13%，表明精密度良好。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。計(jì)算得鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.14%，表明穩(wěn)定性良好。（5）重現(xiàn)性試驗(yàn)。計(jì)算得鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.14%，表明重現(xiàn)性良好。（6）加樣回收率試驗(yàn)。由表1可知，平均回收率為97.30%，RSD為1.57%，表明該測定方法快速、重現(xiàn)性好，可用于八味獐牙菜丸中鹽酸小檗堿成分的含量測定。

2.4樣品溶液的含量測定 以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得10批樣品中鹽酸小檗堿的含量分別為2.66、3.74、2.61、2.73、2.70、2.57、2.63、2.83、2.72和2.55 mg/g，平均含量為2.77 mg/g。

3結(jié)論與討論

由于原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)成藥中小檗皮未進(jìn)行定量控制，因此增訂了用高效液相法測定小檗皮中鹽酸小檗堿的含量測定項(xiàng)。含量測定方法優(yōu)化時(shí)，嘗試用乙腈-濃度0.1%磷酸溶液，無水甲醇-水-冰醋酸-三乙胺溶液，乙腈-磷酸二氫鉀溶液等多種流動(dòng)相，最后選擇乙腈-濃度0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25∶75，V/V）為流動(dòng)相，被測組分達(dá)到良好地分離度并且有較好的峰形。根據(jù)分別測得2個(gè)廠家10批樣品中鹽酸小檗堿含量在2.55～3.74 mg/g，平均含量為2.77 mg/g，查閱文獻(xiàn)可知[3-10]，小檗皮中鹽酸小檗堿的含量因產(chǎn)地不同而差異較大，故在藏成藥生產(chǎn)過程中還需嚴(yán)格控制小檗皮產(chǎn)地來源以確保藥品質(zhì)量。

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