楊梟等

摘 要 為了分析SlARF2基因在番茄生長發(fā)育過程中的功能，利用定量PCR技術分析SlARF2基因的表達模式，發(fā)現(xiàn)SlARF2基因在番茄花芽中表達量最高，在幼果中次之，說明SlARF2基因可能在番茄花果發(fā)育中起著重要作用。為進一步研究SlARF2的功能，構建SlARF2基因超表達、抑制表達載體，農(nóng)桿菌介導轉化番茄成功獲得了相應轉基因植株。通過與野生型番茄植株花、果不同時期的表型進行比對分析，發(fā)現(xiàn)SlARF2基因的超表達對花的形態(tài)學特征無明顯影響，但能夠顯著提高植株的結實率、降低果實大小和重量。說明SlARF2基因參與調(diào)控番茄花、果發(fā)育過程。

關鍵詞 番茄；SlARF2；表達模式；果實發(fā)育

中圖分類號 S641.2 文獻標識碼 A

Abstract To investigate the function of SlARF2 in tomato development， we analyzed the expression pattern of SlARF2 by Real-time PCR. We found that SlARF2 was highly expressed in tomato bud and immature fruit， suggesting that SlARF2 plays an important role in tomato flower and fruit development. Furthermore， we constructed SlARF2 overexpression and suppress expression vectors. By agrobacterium infection， we finally obtained the SlARF2 overexpression and suppress transgenetic tomatoes. Compared the transgenetic tomatoes to wild type tomato， we found that SlARF2 had no affection in the morphology of flower， however SlARF2 overexpression strongly enhanced the rape rate of tomato and decreased the size of tomato fruit. The study demonstrates that SlARF2 regulates the development of tomato flower and fruit， and provides basic reference for further study of SlARF2 function.

Key words Tomato； SlARF2； Expression pattern； Fruit development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.015

生長素是植物生長激素中最為重要的一種激素，通過調(diào)節(jié)早期生長素響應基因的表達，調(diào)控植物生長發(fā)育的多個階段如：頂端優(yōu)勢、向性生長、側根的形成、微管的分化、胚胎發(fā)育等[1]。在早期生長素響應基因的啟動子區(qū)域包含一個保守的順式作用元件TGTCTC，稱為生長素響應元件（AuxRE）[2]。能夠與該元件結合并調(diào)節(jié)生長素響應的一種轉錄因子稱為生長素響應因子（auxin response factor ARFs）。ARFs是植物生長素信號途徑中一個重要的轉錄因子，它正向或者反向的調(diào)控生長素相關基因的表達，從而調(diào)控植物生長發(fā)育過程[3]。通過對番茄、擬南芥、土豆、水稻、葡萄ARF家族成員的蛋白質(zhì)序列比對分析，建立系統(tǒng)進化樹，將ARF家族劃分為四個分支。其中，ARF I a， II b， III and IV 亞家族基因的蛋白中間區(qū)域含有一個抑制功能域，推測這些亞家族的ARF蛋白為轉錄抑制子[4-5]。ARF2基因屬于ARF I a亞家族成員，作為一個潛在的生長素負調(diào)控轉錄因子，已經(jīng)在多種模式植物中被克隆研究。在擬南芥中，arf2突變體表現(xiàn)出對植物生長發(fā)育多向性的調(diào)節(jié)影響，包括植株變大、組織形態(tài)異常等[6]。ARF2基因在植物生長發(fā)育的多個階段都有表達，arf2突變體在植物衰老的多個過程中均表現(xiàn)出明顯的延遲現(xiàn)象，包括花的脫落，葉的衰老以及角果的成熟[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，arf2突變能促使組織細胞分裂增強，arf2突變株系中，莖和蓮座中與細胞周期相關的CYCD3；1基因和與細胞分裂相關的ANT基因表達時期都被相應的延長，說明ARF2是一個細胞分裂和組織發(fā)育的抑制因子[8]。ARF2還介導生長素與其他植物激素的互作。乙烯可以通過蛋白酶體途徑介導ARF2蛋白的降解，并且該過程與乙烯促進生長素的合成途徑是相互獨立的[9-10]。在生長素和ABA交互通路中ARF2與HB33作為新型的調(diào)控因子，對植物生長起著重要的調(diào)控作用[11]。油菜素內(nèi)酯（BR）調(diào)控通路中的重要基因BIN2磷酸化會導致ARF2的DNA結合和抑制能力缺失，BIN2通過鈍化ARFs增強生長素誘導基因的表達[12]。ARF2對番茄生長與發(fā)育具體的調(diào)控功能，尤其是對花和果實發(fā)育的作用至今仍不清楚。本文以番茄SlARF2基因作為研究目標，分析其在番茄花與果實發(fā)育中的功能，以期為明確番茄SlARF2的發(fā)育調(diào)控功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 番茄（Solanum lycopersicum，cv Micro Tom）、大腸桿菌JM109和農(nóng)桿菌（Agrobacterium）菌株C58由本實驗室保存。1.2.3 植物表達載體的構建 克隆SlARF2基因全長時，在引物F1的 5′端設計加入BamH I酶切位點，在引物F2 的5′端設計加入Xba I酶切位點?？寺〉玫骄哂蠦amH I、Xba I雙酶切位點的全長基因。BamH I、Xba I雙酶切處理pCAMBIA-35S載體，37 ℃，1 h，膠回收純化。T4連接酶連接處理過后的SlARF2基因片段和pCAMBIA-35S載體，16 ℃過夜，轉入大腸桿菌。菌落PCR篩選鑒定陽性克隆，提質(zhì)粒，得到pCAMBIA-35S-SlARF2超表達載體。選取全長基因中約600 bp的基因片段，設計引物Fs和Rs，在Fs的5′端設計加入Xba I酶切位點，在Rs的5′端設計加入BamH I酶切位點?？寺〉玫降幕蚱芜B接至BamH I、Xba I雙酶切處理的pCAMBIA-35S載體。篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到pCAMBIA-35S-asARF2反義抑制載體。

1.2.4 轉基因植株獲得及鑒定 葉盤法轉化番茄，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，GUS報告基因染色篩選，初步獲得陽性轉基因植株[14]。轉基因植物SlARF2基因表達量鑒定：取各植株同一時期植株葉片提取RNA反轉錄cDNA，以之為模板進行定量PCR檢測（具體步驟見組織表達模式分析），得到各株系SlARF2基因表達量，以野生型中SlARF2表達量為1，確定轉基因植株是否超表達或抑制表達。

1.2.5 植物表型鑒定 結實率=所收獲的果實數(shù)/開花數(shù)。番茄果實直徑大小用游標卡尺測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用Excel進行方差分析，最小顯著差數(shù)法（LSD法）進行顯著性分析，每個數(shù)據(jù)樣本n≥5，不同的字母代表差異顯著，** 代表差異極顯著，* 代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ARF2基因的克隆與結構功能域分析

以番茄總RNA反轉錄成的cDNA為模板，用特異性引物F1和R1進行PCR反應，得到約2 560 bp的片段（圖1-A）。將測序結果與數(shù)據(jù)庫中番茄SlARF2基因比對，確認所得片段為ARF2基因。番茄ARF2基因與擬南芥ARF2基因的蛋白質(zhì)序列比對，相似性為61.7%，2個基因都含有3個明顯的保守結構功能區(qū)域Domain I、Domain II、Domain III（圖1-B），這3個保守結構功能域分別為B3-DNA結合區(qū)域、Auxin response factor生長素響應區(qū)域以及AUX/IAA家族基因轉錄激活區(qū)域，屬于典型的ARF家族保守結構功能域。

2.2 SlARF2植物表達載體的構建

將帶有酶切位點的SlARF2全長基因和中間片段，連接至酶切處理的pCAMBIA-35S植物表達載體，轉化大腸桿菌，經(jīng)PCR、酶切驗證。確定目的片段已成功的連接到載體。測序結果表明，基因序列及連接方向正確。表明成功構建了SlARF2超表達載體pCAMBIA-35S-SlARF2和反義抑制載體pCAMBIA-35S-asARF2（圖2）。通過凍融法將成功構建的表達載體轉入農(nóng)桿菌C58中。

2.3 SlARF2基因在番茄各組織中的表達模式分析

定量PCR分析SlARF2的表達模式。結果發(fā)現(xiàn)在番茄根、莖、葉營養(yǎng)生長階段SlARF2的表達量呈明顯的上升趨勢，在根中表達最低，莖的表達量約為根中的10倍，葉的表達最高，約為根中的13倍。進入生殖生長階段后的花芽期達到最高，約為根中表達量的17倍，花和幼果時期的表達量有所下降，為根中表達量的12倍左右，在果實發(fā)育階段SlARF2的表達量明顯下降并趨于平穩(wěn)，為根中表達量的5～7倍（圖3）。由此推測SlARF2基因對番茄花以及果實的發(fā)育形成具有調(diào)控作用。

2.4 SlARF2基因在果實形成發(fā)育中的功能分析

為了分析番茄SlARF2基因在番茄果實形成發(fā)育過程中的功能，設計構建SlARF2基因的超表達及反義抑制載體，通過遺傳轉化成功獲得了4個超表達轉基因株系，ARF2-1、ARF2-3、ARF2-4、ARF2-5和1個反義抑制轉基因株系As-ARF2。提取各轉基因植株60 d的葉片RNA，反轉錄得到的cDNA，定量PCR檢測各個植株的轉基因表達情況。結果表明，轉基因株系ARF2-1、ARF2-3中ARF2基因的表達量較高，約為野生型表達量的13倍，ARF2-4植株SlARF2的表達量較低，約為野生型表達量的7倍，ARF2-5植株的SlARF2表達量相對野生型無明顯變化，反義抑制植株As-ARF2中SlARF2基因的表達量明顯降低，約為野生型中表達量的0.5倍（圖4-A）。通過統(tǒng)計植物開花期各轉基因植株的開花數(shù)量，并與相同生長條件下同時期的野生型植株進行對比，結果表明，開花期各轉基因植株的開花數(shù)量基本一致（平均每株25朵左右），證明ARF2基因表達量的差異并不能對花的形成產(chǎn)生明顯的影響。

在番茄幼果形成期，對各轉基因株系的結實率進行統(tǒng)計，結果顯示：4個SlARF2超表達轉基因株系的結實率明顯高于野生型植株，其中ARF2-3株系的結實率最高，ARF2-5次之，ARF2-4和ARF2-1相對于野生型植株也相應增高，As-ARF2反義抑制株系的結實率明顯低于野生型植株（圖4-B）。證明SlARF2基因的超表達對果實座果有著一定的促進作用。進一步對成熟期果實進行統(tǒng)計分析。結果發(fā)現(xiàn)，各轉基因株系的果實在數(shù)量、大小以及重量上有著明顯的差異。ARF2-3的果實大小、重量明顯小于其他各株系，ARF2-4、ARF2-1株系的果實大小、重量也明顯小于野生型植株果實，ARF2-5株系以及As-ARF2反義抑制株系的果實大小、重量與野生型果實相比無明顯變化（圖4-C、D；圖5）。同時SlARF2基因表達量的變化與轉基因植株果實大小、重量的變化成明顯的線性關系（圖4-E）。以上-數(shù)據(jù)表明，隨著SlARF2基因表達量的提高，轉基因株系果實的大小和重量相應減小。

綜上所述，在番茄果實發(fā)育過程中SlARF2基因顯著影響了植株的結實率、果實大小和重量，證明ARF2基因是調(diào)控果實發(fā)育的一個重要因子。

3 討論與結論

本研究以番茄SlARF2基因為對象，成功構建了SlARF2基因的超表達和反義抑制載體，并獲得了相應的轉基因植株作為后續(xù)分析材料。通過對SlARF2基因表達模式的分析，發(fā)現(xiàn)SlARF2基因的主要表達時期處于番茄的生殖生長階段，從花芽開始貫穿于花、果發(fā)育的整個過程中。通過對所得到的轉基因株系材料的花、果分析發(fā)現(xiàn)，SlARF2基因在花蕾中表達量最高，在開放花中表達量也較高，但對花的形成并沒有產(chǎn)生明顯的影響。在其他研究中，擬南芥arf2突變株系中會表現(xiàn)出花形態(tài)異常，開花延遲和花序長而密集的表型[5]。因此，為了明確SlARF2基因在番茄花形成階段的功能，還需要進一步對所得到的轉基因植株開花時期的對應生理生化指標進行研究。

本研究通過對轉基因植株的SlARF2基因表達量，結實率以及成熟后果實的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)各植株的結實率、果實大小和重量與SlARF2基因的表達量呈明顯的線性關系（圖4-E），SlARF2基因表達量越高則結實率越高，成熟后的果實則越小，這與arf2突變株系在擬南芥中導致花不育的結果吻合[5]。推測SlARF2的表達可能直接影響番茄果實的形成和發(fā)育。SlARF2基因對于植物果實結實率以及果實大小的影響可能是因為SlARF2基因的表達直接影響了植物的結實率，而在營養(yǎng)均等的情況下高結實率植株的果實則會表現(xiàn)出相應的營養(yǎng)短缺，從而間接影響果實的大小。由此在后續(xù)研究中，需要進一步證明SlARF2基因調(diào)控植物結實率以及果實大小之間的聯(lián)系。SlARF2轉基因株系果實表現(xiàn)出較為明顯的果實表型：果實大小有著明顯的差異，同時各SlARF2超表達株系的果實呈現(xiàn)圓潤且飽滿，而野生型果實的底部明顯尖細且果實呈心型（圖5），這與同家族基因SlARF7的研究具有一致性[15]，從形態(tài)學分析，可能是由于SlARF2直接影響了番茄的細胞分裂所致。但結合結實率受影響這一結果，推測可能是因為SlARF2基因在果實形成過程中影響了營養(yǎng)的分配所致，對此尚有待深入研究。

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