牛心等

摘 要 選取正常荔枝葉片和受荔枝瘤癭螨為害的荔枝葉片為樣品，分別以索氏提取法和超聲波提取法進(jìn)行萃取，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)不同葉片中的脂溶性成分進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果表明，荔枝瘤癭螨的為害會(huì)引起宿主葉片化學(xué)成分以及含量的變化，主要表現(xiàn)為抗逆相關(guān)成分如γ-谷甾醇等植物甾醇類(lèi)物質(zhì)含量的增多，以及與光合作用相關(guān)的成分如植物醇等化合物含量的減少。

關(guān)鍵詞 荔枝瘤癭螨；索氏提取法；超聲波提取法；GC-MS

中圖分類(lèi)號(hào) S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The secondary metabolites of litchi leaves during the growth of normal and Aceria litchii（Keifer）invasion were extracted by Soxhlet and Ultrasonic methods. Then， the constituents were separated and indentified with GC-MS. The results showed the chemical composition and content of litchi leaves changed after Aceria litchii（Keifer）invasion， mainly reflected in the elevated levels of phytosterol， such as γ-clionasterol， and the reduced levels of phytol， which was involved in plant defense and photosynthesis respectively.

Key words Aceria litchii（Keifer）； Soxhlet extraction； Ultrasonic extraction； GC-MS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.033

荔枝瘤癭螨[Aceria litchii（Keifer）]又名荔枝毛癭螨或毛蜘蛛，是危害荔枝和龍眼的主要害螨，主要分布于我國(guó)南方荔枝龍眼產(chǎn)區(qū)以及泰國(guó)、印度、美國(guó)佛羅里達(dá)州及夏威夷、澳大利亞、巴基斯坦等國(guó)家和地區(qū)[1-2]。荔枝瘤癭螨主要危害寄主葉片，也可為害嫩梢和花果。葉片受害后葉面凸起，并從另一面凹陷處長(zhǎng)出白色絨毛，絨毛漸變成黃褐色到紅褐色，而且濃密，故稱(chēng)毛氈病[3]。受害嚴(yán)重的葉片完全失去其功能，最后干枯凋落。

蟲(chóng)癭是由昆蟲(chóng)等致癭生物誘導(dǎo)寄主植物細(xì)胞分裂加速而產(chǎn)生的一種異常組織[4-7]。蟲(chóng)癭組織為致癭昆蟲(chóng)提供了生長(zhǎng)發(fā)育所需的基本食物源[8-9]，也為昆蟲(chóng)提供了抵御不良外界自然環(huán)境的棲身之地[10]。同時(shí)保護(hù)致癭昆蟲(chóng)不受天敵的捕食[11]。蟲(chóng)癭形成過(guò)程中，致癭昆蟲(chóng)會(huì)造成周?chē)糠旨闹骷?xì)胞和組織的異常生長(zhǎng)，進(jìn)而阻礙寄主植物的正常生長(zhǎng)，并影響其生理活動(dòng)，如光合作用等。同時(shí)，寄主植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物也發(fā)生相應(yīng)變化，以應(yīng)對(duì)其危害，如酚類(lèi)物質(zhì)、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的增加以及苯丙氨酸解氨酶活性（PAL）的提高等[12-15]。同樣，荔枝瘤癭螨入侵后的寄主葉片上會(huì)形成蟲(chóng)癭，其形成必然會(huì)影響荔枝葉片細(xì)胞的生理生化代謝。但迄今為止，相關(guān)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選取正常荔枝葉片和受荔枝瘤癭螨為害的荔枝葉片為材料，分別采取索氏提取法和超聲波提取法提取樣品，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）對(duì)不同葉片中的脂溶性成分進(jìn)行分析與鑒定，進(jìn)而對(duì)2種材料的相關(guān)成分進(jìn)行初步對(duì)比，為荔枝瘤癭螨致畸機(jī)理和寄主植物抗病機(jī)制的研究提供線(xiàn)索，同時(shí)為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提取方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 荔枝瘤癭螨采集自海南省儋州市寶島新村荔枝園。荔枝樹(shù)苗（品種：妃子笑）購(gòu)自海南大學(xué)園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)苗圃，先盆栽種植于瓊臺(tái)師院溫室大棚2個(gè)月，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后選取20株生長(zhǎng)一致的樹(shù)苗進(jìn)行荔枝瘤癭螨接種，同時(shí)取20株作為對(duì)照，待55 d荔枝瘤癭螨為害數(shù)量最多時(shí)分別采集接種葉片和對(duì)照組葉片作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)材料用蒸餾水洗凈后放 置陰處，待晾干后裝袋并置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 儀器和試劑 試驗(yàn)所用主要儀器有HP6890/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；索氏提取器（上海仙象儀器儀表有限公司）。

試劑有乙醇（分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠(chǎng)）、氯仿（重蒸工業(yè)級(jí)，上海化學(xué)試劑總廠(chǎng)）、正己烷（分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠(chǎng)）。

1.2 方法

1.2.1 索氏提取法 將樣品剪碎放入折疊好的濾紙紙筒內(nèi)，稱(chēng)重封口，封口捏出凹面，在圓底燒瓶?jī)?nèi)加入300 mL的乙醇，放入玻璃球防止爆沸，安裝索氏提取器，加熱保持有液體不斷回流至樣品管內(nèi)即可，虹吸5次，回收提取液，蒸干濃縮至無(wú)醇味，加入150 mL純水溶解蒸干的提取物，倒入錐形瓶?jī)?nèi)，加入150 mL氯仿，進(jìn)行混合，靜置15 min，吸出下層溶液，上層溶液再次加入150 mL氯仿進(jìn)行萃取，共進(jìn)行3次。將氯仿層和水層分別進(jìn)行蒸干濃縮，準(zhǔn)備質(zhì)譜分析。

1.2.2 超聲波提取法 取樣品50.0 g剪碎；用正己烷浸提3次，每次超聲波處理30 min；過(guò)濾并合并3次正己烷提取液，對(duì)提取液進(jìn)行蒸干濃縮，準(zhǔn)備質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)GC-MS檢測(cè)分析得總離子流圖（圖1～4）及各化學(xué)成分相對(duì)含量（表1）。

2.1 索氏提取法和超聲波提取法對(duì)提取荔枝葉片化合物總量的比較

采用兩種不同的方法，從荔枝受害葉片與正常葉片中共分離鑒定出47種化合物（表1）。其中索氏提取法中對(duì)照組提取了20種化合物，處理組提取了21種化合物；超聲波提取法中對(duì)照組提取了35種化合物，處理組提取了23種化合物。在索氏提取法中，鑒定出的化合物含量占提取物總量（1 mg）的百分比，分別為對(duì)照組72.653%，處理組59.098%。超聲波提取法中，鑒定出的化合物含量占提取物總量（1 mg）的百分比，分別是對(duì)照為54.581%，處理為43.386%。

2.2 索氏提取法和超聲波提取法對(duì)提取荔枝葉片化合物含量和數(shù)量的比較

從分析結(jié)果（表1）可以看出，兩種方法提取的成分差異較大，對(duì)照組與處理組間也存在較大差異，部分物質(zhì)含量也發(fā)生了變化。兩種方法得到的提取物主要由烴類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)、酸類(lèi)構(gòu)成。其中索氏提取中對(duì)照組特有的成分有4-[（1E）-3-羥基-1-丙烯基]-2-甲氧基苯酚、角鯊烯、β-生育酚、環(huán)鴉片甾烯醇，處理組特有的成分有α-蛇麻烯、杜松腦、亞油酸、硬脂酸、膽甾二烯、β-香樹(shù)脂醇乙酸酯。超聲波提取中對(duì)照組特有的成分有雙環(huán)欖香烯、朱欒倍半萜、表雙環(huán)倍半水芹烯、香樹(shù)烯、刺伯烯、δ-杜松烯、大根香葉烯B、石竹烯氧化物、異匙葉桉油烯醇、橄欖酸酰胺、三十二烷，處理組特有的成分僅有1-二十六醛。4種樣品中均存在的共性物質(zhì)有4，6-二甲基-十二烷、異金合歡醇、新植二烯、二十一烷、植物醇、維生素E、β-豆甾醇、γ-谷甾醇。兩種提取方法中4，6-二甲基-十二烷、異金合歡醇、二十一烷、γ-谷甾醇等化合物含量處理組均高于對(duì)照組，而植物醇則表現(xiàn)為處理組比對(duì)照組相對(duì)含量降低。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別采用索氏提取法和超聲波提取法對(duì)兩種樣品的脂溶性成分進(jìn)行了提取比較，從兩種方法鑒定出的化合物含量占提取物總量的百分比均表現(xiàn)為對(duì)照組高于處理組。推斷其可能與荔枝瘤癭螨的為害導(dǎo)致荔枝葉片細(xì)胞增生或非正常生長(zhǎng)，從而引起葉片成分與含水量發(fā)生了變化有關(guān)。其次，荔枝瘤癭螨的為害會(huì)造成荔枝葉片的局部枯萎，這也可能是對(duì)照組高于處理組的一個(gè)原因。

綜合兩種提取方法，本試驗(yàn)獲得了4種生育酚，分別為δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及維生素E。與對(duì)照相比，這4種生育酚的含量除維生素E外，均在侵染后的荔枝葉片中有不同程度的降低。生育酚在自然界是由高等植物的綠葉經(jīng)過(guò)光合作用合成，生育酚含量的降低，從側(cè)面反映出，植物光合作用能力的降低[16]。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組相比處理組植物醇含量明顯降低，索氏提取中異植物醇的含量也明顯下降。異植物醇和植物醇均為植物葉綠素組成成分。由此推斷，荔枝瘤癭螨的為害可能影響了寄主植物葉片葉綠素的合成。

倍半萜類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)極為重要的植物次生代謝物質(zhì)。植食性昆蟲(chóng)主要依靠嗅覺(jué)感受器辨別寄主植物的特異性氣味進(jìn)而趨向寄主植物。特異性氣味的存在減少了昆蟲(chóng)在覓食過(guò)程中的盲目性[17]。在超聲波提取法中，朱欒倍半萜這種倍半萜類(lèi)物質(zhì)的含量出現(xiàn)了對(duì)照組高于處理組的現(xiàn)象。朱欒倍半萜常用于昆蟲(chóng)引誘劑的篩選實(shí)驗(yàn)中。本研究中對(duì)照組含量高于處理組的原因可能與害螨逃避天敵昆蟲(chóng)的一種策略或者與干擾潛在競(jìng)爭(zhēng)者有關(guān)。

所有試驗(yàn)材料的化合物中均含有β-豆甾醇、γ-谷甾醇等植物甾醇類(lèi)物質(zhì)，兩種提取法中γ-谷甾醇的含量處理組相對(duì)于對(duì)照組均明顯升高。有研究表明[18]在植物細(xì)胞膜內(nèi)的植物甾醇與磷脂相互作用能夠保持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性。植物甾醇參與植物對(duì)外界的脅迫反應(yīng)，植物甾醇在植物抵抗許多不利因素（生物的和非生物的）的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[19]。同時(shí)，由表1可看出，二十一烷、二十九烷、三十烷等烷烴類(lèi)物質(zhì)均有所上升，烷烴類(lèi)物質(zhì)是植物表面蠟質(zhì)層的組成部分，蠟質(zhì)層是植物防御體系的重要組成部分，在防止病原物侵染、草食性昆蟲(chóng)及抵御環(huán)境脅迫如干旱、紫外線(xiàn)破壞和霜凍中發(fā)揮重要作用[20]。荔枝葉片在受到荔枝瘤癭螨為害后，葉片內(nèi)甾醇類(lèi)物質(zhì)以及烷烴類(lèi)物質(zhì)含量的升高是否參與了寄主抵御害蟲(chóng)為害的防御機(jī)制還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

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