郭龍芳等

摘要 [目的]研究高壓靜電場對紫花苜蓿組織培養(yǎng)的影響。[方法]利用電場處理紫花苜蓿的子葉和下胚軸，采用正交試驗設計，設定3個水平，研究電場對外植體出愈率的影響。[結果]誘導愈傷組織的最佳濃度組合是1.8 mg/L 2，4D+0.3 mg/L 6BA；下胚軸在培養(yǎng)7 d后出愈率最高條件為頻率3.85 kHz，場強2 kV/cm，時間20 min；20 d后，由于用20 min處理的下胚軸逐漸凋亡，因此下胚軸出愈率最高的條件為頻率3.85 kHz，場強2 kV/cm，時間15 min。試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)電場處理后外植體木質(zhì)化程度較高。[結論]高壓靜電場對紫花苜蓿組織培養(yǎng)具有一定影響。

關鍵詞 電場；紫花苜蓿（Medicago sativa L）；組織培養(yǎng)；木質(zhì)化；影響

中圖分類號 S541+.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03182-04

Abstract [Objective] To study effects of electric field on alfalfa tissue culture. [Method] The cotyledon and hypocotyl of alfalfa is treated with electric field combined with tissue culture technology. We adopted the orthogonal experimental design and set up three levels， in order to study the influence of explant callus induction rate. [Result] The results indicated that the optimal concentration combination of callus induction is 2，4D： 1.8 mg/L， 6BA： 0.3 mg/L； the condition of the highest callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 20min after 7 days cultivation of hypocotyl. After 20 days， 20min treatment has promoted hypocotyl apoptosis， therefore the condition of the highest hypocotyl callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 15 min. In addition， we found that explant lignification degree is higher after electric field treatment. [Conclusion] Electric field has a certain effect on tissue culture of alfalfa.

Key words Electric field； Alfalfa； Tissue culture； Lignification； Effect

紫花苜蓿（Medicago sativa L）是多年生草本植物，是優(yōu)良的牧草和生物能源物質(zhì)，莖稈可以作為生物燃料，葉片可作為優(yōu)質(zhì)飼料、蛋白質(zhì)添加劑等副產(chǎn)品，具有很高的綜合利用價值，是一種很有潛力的土壤修復植物。但種子產(chǎn)量低，優(yōu)良性狀退化，在種子遺傳轉(zhuǎn)化率、氨基酸含量不均衡及耐鹽性、抗病蟲害等方面仍有待進一步提高。

靜電生物效應研究最早、范圍最廣的領域是利用高壓靜電場處理植物的種子，提高種子活力，其研究的范圍從經(jīng)濟作物到玉米、油葵等大田作物，藥用植物到蔬菜、水果、微生物等。靜電場處理種子的生物效應研究起源于半個世紀前，我國在60年代開始進行探索，到20世紀70年代，高壓靜電場的效應問題引起了越來越多人的注意[1-2]，到90年代開始大量的研究，主要探索經(jīng)電場處理后的種子萌發(fā)率、幼苗生長抗旱性的變化并測定了種子萌發(fā)期和幼苗期的生理生化指標。根據(jù)報道，“經(jīng)高壓靜電場處理后，種子的呼吸強度、根系活力、發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有所提高，禾苗長勢好，整齊粗壯，抗病能力強，成熟早，產(chǎn)量也有不同程度的增加。種子在受到靜電場的刺激下，種子蛋白發(fā)生凝聚，電導率降低，過氧化氫酶活性提高，三磷酸腺苷（ATP）含量提高，這些都有利于胚芽吸收和利用，遺傳特性也得到了改善，增強了吸水能力，強化了基本營養(yǎng)物質(zhì)迅速溶解和輸送，萌發(fā)速度快，幼苗生長快而健壯[3-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，靜電場處理過的種子播種一天后吸收強度增強30%，10 d后增強70%～200%[8]。試驗主要結合組織培養(yǎng)的優(yōu)點，用電場處理外植體的子葉和下胚軸，最大可能的保留突變體植株，避免由于自然條件和自身因素的限制，突變細胞被大量淘汰而造成基因庫的浪費。紫花苜蓿是異花授粉植物，自交結實率低，不到1%，雜交育種和雜種優(yōu)勢利用比較困難[9-11]，所以將生物技術與常規(guī)育種方法結合起來進行新品種培育，縮短育種年限，改良苜蓿品質(zhì)，提高育種效率已是一個世界性的普遍趨勢[12-13]，

因此，將誘變育種與組織培養(yǎng)相結合無疑是很有意義的。筆者主要探索電場對苜蓿愈傷組織培養(yǎng)的影響，結合離體培養(yǎng)技術分析經(jīng)處理后的愈傷組織對苜蓿愈傷組織生長、分化的影響，以期為提高苜蓿轉(zhuǎn)基因效率提供良好的突變體受體材料和試驗參考數(shù)據(jù)，并為加快我國苜蓿的育種步伐奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。選取籽粒飽滿的準格爾苜蓿種子，由中國農(nóng)科院草原研究所提供。

1.1.2 主要儀器。試驗采用的電場是由2塊直徑60 cm圓形金屬平板電極產(chǎn)生，兩極板間距5 cm。放外植體的培養(yǎng)皿單層置于接地電極板上，調(diào)節(jié)2極板電場頻率和電壓設定處理條件；可調(diào)頻高壓電源，購自大連理工大學靜電與特種電源研究所，可產(chǎn)生極板的電場頻率和電壓，可調(diào)頻率范圍為3.6～18.0 kHz。

1.2 方法

1.2.1 種子滅菌及無菌苗的制備。將苜蓿種子放入25 ml的三角瓶中，用濃度70%酒精浸泡2 min，棄掉酒精再加入濃度10%的次氯酸鈉，浸泡45 min左右，期間搖晃數(shù)次，倒掉消毒液，隨后用無菌水沖洗3～5次，最后在無菌水中浸泡3～4 h，把種子放在無菌濾紙上吸干多余的水分，置1/2MS（medium of Murashige and Skoog，2013）固體培養(yǎng)基上，光照強度為3 000 lx，16 h光照/8 h黑暗，溫度（25±1） ℃。

1.2.2 外植體的處理。取7 d左右無菌苗的子葉和下胚軸，子葉被剪成四塊，下胚軸剪成3～4 mm的小段，放到誘導愈傷組織的培養(yǎng)基上。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備。（1）無菌苗培養(yǎng)基。1/2MS+濃度0.3%瓊脂粉+15 g/L蔗糖。（2）誘導愈傷組織的培養(yǎng)基。1/2MS+濃度0.3%瓊脂粉+15 g/L蔗糖，分別附加濃度分別為1.5、1.8和2.0 mg/的2，4D，以及濃度分別為0.3、0.5和1.0 mg/L的6BA，共9組不同濃度的組合。

1.2.4 胚性愈傷組織的培養(yǎng)。在超凈臺內(nèi)，將子葉和下胚軸放在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿放20個外植體，子葉和下胚軸分別設2個重復，共36個培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)15 d后，計數(shù)不同濃度組合下培養(yǎng)基上愈傷組織的數(shù)量，并將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導胚狀體的培養(yǎng)基上。

1.2.5 誘導胚狀體的培養(yǎng)。設定2組培養(yǎng)基，1組為UM培養(yǎng)基+0.2 mg/L KT+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D；另1組為UM培養(yǎng)基+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D，研究KT對胚狀體的發(fā)生與成熟的影響。在無菌條件下，用鑷子將胚性愈傷組織掰成直徑為2 mm的小塊，然后再放到培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿里放20塊，培養(yǎng)36 d后，計數(shù)成熟胚狀體的數(shù)量，再將成熟胚狀體移到不含任何生長激素的1/2MS+0.3%瓊脂粉+15 g/L蔗糖上，完成生根。

1.2.6 電場處理外植體。將子葉和下胚軸在無菌條件下放在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿放20個外植體，子葉和下胚軸分別設3個重復，共54個培養(yǎng)皿，1 080個外植體，取子葉和下胚軸各3個培養(yǎng)皿放在高壓靜電場的2平行極板間，其具體操作如圖1。在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d后，計數(shù)培養(yǎng)基上愈傷組織的數(shù)量，20 d后，計數(shù)胚性愈傷組織的數(shù)量，并將其轉(zhuǎn)移到誘導胚狀體的培養(yǎng)基上。

電場處理外植體后，出愈率明顯提高，特別是在f=3.85 kHz，E=2 kV/cm，T=20 min時，下胚軸出愈率為91.4%，高于未處理的出愈率81.2%。并且電場處理后的外植體木質(zhì)化程度加強，可能是促進木質(zhì)素的沉積使細胞壁變得堅硬牢固，其具體原因需進一步去探討。在后續(xù)的試驗中，將會用不同激素濃度組合的培養(yǎng)基誘導胚狀體，找出誘導分化率的最佳組合。因此，靜電場對紫花苜蓿外植體的出愈率等均有刺激作用，但其作用機理仍有待今后繼續(xù)研究。

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