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        嗜水氣單胞菌的分離與16SrDNA鑒定

        2014-04-29 16:09:53孫亭亭等
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年13期
        關(guān)鍵詞:水氣單胞菌生化

        孫亭亭等

        摘要 [目的]分離并鑒定魚(yú)嗜水氣單胞菌,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析。[方法]從云南某魚(yú)場(chǎng)采集發(fā)病魚(yú)的病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離與培養(yǎng),并對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定、16S rDNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。[結(jié)果]分離培養(yǎng)到1株細(xì)菌,命名為Ah1305。經(jīng)表型鑒定、生化試驗(yàn)及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定為嗜水氣單胞菌。[結(jié)論]該研究可為快捷、準(zhǔn)確檢測(cè)魚(yú)嗜水氣單胞引起的疾病提供參考。

        關(guān)鍵詞 嗜水氣單胞菌;分離鑒定;16S rDNA

        中圖分類號(hào) S182;Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2014)13-03907-04

        Abstract [Objective] The aim was to isolate and identify Aeromonas hydrophila and establish the phylogeny. [Method] Lesion tissue of fish was collected from a certain farm in Yunnan Province, and then the isolated strain was identified by preliminary identification, 16S rDNA identification and phylogenetic analysis. [Result] The bacteria were isolated and named as Ah1305. Through the morphological identification, biochemical test and 16S rDNA phylogeny analysis, it was identified as Aeromonas hydrophila. [Conclusion] The study can provide reference for quick and accurately test the disease caused by Aeromonas hydrophila.

        Key words Aeromonas hydrophila; Isolation and identification; 16S rDNA

        致病性嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬于氣單胞菌科(Aermonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas),是革蘭氏陰性短桿菌,兩端鈍圓,直或略彎,單個(gè)或成雙排列,有極端單鞭毛,固體培養(yǎng)基上有周鞭毛,無(wú)莢膜,不形成芽孢,最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃。嗜水氣單胞菌普遍存在于淡水、海水、污泥、淤泥以及土壤中,是一種人畜共患病的病原。患病魚(yú)出現(xiàn)爛尾、鰭充血,導(dǎo)致出血性敗血癥和流行性潰瘍綜合癥(EUS)等癥狀[1-2],近些年來(lái)有大量的報(bào)道表明嗜水氣單胞菌還可以引發(fā)人類的腹瀉、中毒病、外傷性感染以及敗血癥等病癥[3],其致病作用已引起公眾的關(guān)注,該菌在國(guó)外被作為腹瀉病原菌進(jìn)行檢測(cè)[4-5]。致病菌株除感染魚(yú)及人類以外,還可以感染多種動(dòng)物(如兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類[6]等),給養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生帶來(lái)了巨大損失。

        筆者從云南某發(fā)病魚(yú)場(chǎng)送檢病料中分離到1株細(xì)菌,并對(duì)其進(jìn)行表型鑒定及16S rDNA鑒定,以期為魚(yú)場(chǎng)該病的檢測(cè)與防治提供科學(xué)依據(jù)[7-11]。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1

        病料。采集云南省某魚(yú)場(chǎng)發(fā)病魚(yú)。將發(fā)病癥狀明顯的魚(yú)無(wú)菌解剖,取病變明顯的肝臟、脾臟及肌肉,4 ℃下保存。

        1.1.2

        培養(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基,購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。糖類發(fā)酵等生化管,購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。血液瓊脂培養(yǎng)基。

        1.1.3

        主要試劑及儀器。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP2001)、多功能DNA純化回收試劑盒(DP1501),購(gòu)自BIOTEKE公司。TaKaRa rTaq DNA酶、DL2000 Marker,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。凝膠成像儀、PCR擴(kuò)增儀,購(gòu)自BIO-RAD公司,電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

        1.2 方法

        1.2.1

        分離培養(yǎng)。將病魚(yú)體表消毒,無(wú)菌取病變組織,剪碎研磨。用無(wú)菌生理鹽水對(duì)病料進(jìn)行10倍稀釋,分別接種于TSA培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基,置于28 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài),挑取灰白色發(fā)生溶血的可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。將染色中有陰性短桿菌的菌落在TSA培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基上分離與純化。

        1.2.2

        形態(tài)觀察。將分離純化后的細(xì)菌按照常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

        1.2.3

        生理生化試驗(yàn)。將純培養(yǎng)的分離菌接種于生化培養(yǎng)基,進(jìn)行各種糖發(fā)酵試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn),28 ℃下培養(yǎng)24~48 h,記錄培養(yǎng)結(jié)果。

        1.2.4

        分子生物學(xué)鑒定。

        (1)引物設(shè)計(jì)。參照GenBank已發(fā)表的16S rDNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物,上游引物:27F(5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3),下游引物:1492R(5GGTTACCTTGTTACGACTT3)。引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成。

        (2)制備模板:將分離菌株用TSA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟操作,提取細(xì)菌總DNA。

        (3)PCR反應(yīng)體系:TaKaRa rTaq(5 U/μl) 0.5 μl、10×PCR Buffer 3 μl、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μl、上游引物0.5 μl(10 pmol/L)、下游引物0.5 μl(10 pmol/L)、模板DNA 2 μl(50 ng)、滅菌雙蒸水21 μl、共30 μl。

        PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min,4 ℃保存,通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

        按照DNA純化(膠回收)試劑盒說(shuō)明書操作步驟對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,并送交華大基因測(cè)序。

        1.2.5

        系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。用BLAST將分離株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比對(duì),并選取19株作為參比序列。將分離株序列與參比序列使用軟件DNAMAN進(jìn)行同源性分析,計(jì)算同源性數(shù)值。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分析分離株與參比株的親緣關(guān)系,鑒定分離株的種屬。參比序列的名稱、登錄號(hào)、登錄時(shí)間、分離來(lái)源及分離地區(qū)見(jiàn)表1。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 培養(yǎng)特性

        通過(guò)細(xì)菌分離,得到1株細(xì)菌,命名為Ah1305。在TSA固體培養(yǎng)基上,形成半透明、圓形、中央凸起、邊緣光滑的小菌落,直徑在1 mm左右。在血液瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色的菌落,產(chǎn)生β型溶血圈(圖1)。

        2.2 細(xì)菌形態(tài)

        3 討論

        在臨床上魚(yú)類的細(xì)菌病中,很多具有共同的癥狀(如體表充血、發(fā)紅、潰爛、腹部膨大、腹水等),只依靠臨床癥狀來(lái)判斷及治療有很大盲目性,需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診[12]。實(shí)驗(yàn)室鑒定魚(yú)類細(xì)菌性疾病病原的方法有很多,主要包括生理生化特性鑒定技術(shù)(如用ATB細(xì)菌鑒定儀)[13-14] 、免疫學(xué)診斷技術(shù)(如間接ELISA)[15-16]、分子生物學(xué)方法[17-20](如LAMP)[21-22]等。PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷,已被較多應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)。檢測(cè)的目的基因也有多種,如溶血素基因[23-24]、氣溶素基因[25]、絲氨酸蛋白酶基因[26]、16S rDNA[27-28]等。

        以16S rDNA為目的基因的PCR鑒定方法最為成熟,也取得了較顯著的成果。與表形鑒定、生理生化鑒定等傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法相比,該方法操作簡(jiǎn)便,省時(shí),且避免了傳統(tǒng)生化試驗(yàn)的不穩(wěn)定性。與針對(duì)其他基因的PCR鑒定方法相比,16S rDNA基因具有高度保守性的特點(diǎn),穩(wěn)定性好,可靠性高。對(duì)于混合感染的病例,可做到一次檢測(cè)多種病原菌。該方法方便快捷,成本較低,準(zhǔn)確性高,對(duì)于癥狀相似的疾病能夠做到準(zhǔn)確、快速鑒定病原菌,從而指導(dǎo)臨床治療,避免因誤診而造成的損失。

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