劉學群等

摘要 [目的]獲得外源表達的可溶性水稻VDAC3蛋白。[方法]將osvdac3基因克隆到含有GST標簽的pGEX-4T-1原核表達載體中，轉化入BL21表達菌株，經IPTG誘導，并使用SDSPAGE和Western Blot檢測分析表達產物，通過Glutathione Resin 親和層析系統(tǒng)純化獲得較純的目的蛋白。[結果]試驗成功構建了pGEX4T1osvdac3原核表達載體并轉化大腸桿菌。通過SDSPAGE和Western Blot試驗證實56 kD處的蛋白條帶是具有可溶性表達的VDAC3蛋白。[結論]經Glutathione Resin親和層析系統(tǒng)純化得到可溶性帶GST標簽的VDAC3蛋白。該研究結果為水稻VDAC蛋白的功能研究進一步奠定了基礎。

關鍵詞 原核表達；GST標簽；親和純化

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03815-04

Abstract [Objective] To achieve activated OsVDAC3 protein in vitro.[Method] The recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 with the GSTtag was constructed and transformed into E.coli.TheGsttagged OsVDAC3 protein was induced with IPTG in E.coli strain BL21， and confirmed by SDSPAGE and WesternBlot analysis.In addition， the GSTtagged recombinant OsVDAC3 protein was purified by Glutathione resin.[Result] The results showed that the recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 was constructed and transformed into E.coli successfully.The results of SDSPAGE and Western Blot showed a band in the 56 kD and indicated the GSTtag OSVDAC3 protein was partly existed in the soluble composition.[Conclusion] The GSTtag OsVDAC3 protein was isolated and purified by using Glutathione Resin.The research laid a foundation for the further study of the function of VDAC in the rice.

Key words Prokaryotic expression； GST tag； Affinity purification

電壓依賴性陰離子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）是線粒體外膜高度的保守的，最豐富的蛋白，在所有的真核生物中都存在。在調節(jié)代謝物在線粒體與細胞質之間的運輸具有重要的作用[1-2]。在植物中，煙草中至少有3種亞型，擬南芥和百脈根中發(fā)現(xiàn)有5種不同的亞型。較酵母與哺乳動物，植物中有更多的VDAC異構形式，暗示植物VDAC具有多種不同的功能[3-6]。實驗室前期工作證明，水稻基因組中存在8個vdac基因，不同vdac基因在水稻不同組織和生殖發(fā)育時期的表達不同，同時vdac基因的表達受各種生物和非生物的脅迫的影響，如鹽脅迫和熱脅迫等[7-8]。這些結論都表明，不同的VDAC蛋白對水稻生長發(fā)育具有重要作用。羅鳳燕等通過Real-time PCR比較分析了8個vdac基因在紅蓮型水稻不育系YTA不同發(fā)育時期的表達模式，發(fā)現(xiàn)osvdac3在水稻生殖生長期達到較高表達水平，顯示其可能參與水稻的生殖發(fā)育相關過程[8]。江晨等利用Gateway重組克隆技術對水稻YTB中的osvdac3基因進行基因干涉，發(fā)現(xiàn)轉基因植株結實率明顯低于野生型YTB[9]。

在原核細胞表達外源基因過程中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞質內聚集，形成包涵體（ inclusion body）。以包涵體形式存在的蛋白質分子不具有正確的天然三維結構， 表達蛋白不具有生物活性[10-11]，為后續(xù)的研究提供了諸多的不便。VDAC蛋白作為跨膜蛋白，在原核表達時大多以包涵體的形式存在。雖然可以通過蛋白變性等方法可以獲得可溶性蛋白，但這樣得到的可溶性蛋白常常會帶來蛋白結構上的改變，不利于后期的進一步功能研究[12]。因此，試驗以前期得到的與水稻生殖發(fā)育相關的osvdac3基因為對象，構建pGEX4T1osvdac3原核表達載體并嘗試不同的IPTG誘導條件，純化得到可溶性GSTOsVDAC3融合蛋白，以期為下一步獲取與OsVDAC3蛋白相互作用的水稻蛋白及研究該蛋白在水稻生長發(fā)育的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）和原核表達載體pGEX-4T-1，均由中南民族大學武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 主要儀器。752N紫外可見分光光度計，購自上海精科公司；Gene Genius系統(tǒng)，購自SYNOPTICS LTD（英國）；凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Bio-RAD公司；C1000 touch thermal cyclerPCR儀，購自美國Bio-RAD公司；centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機，購自德國eppendorf公司；CR22G高速離心機，購自日本Hitachi公司；FB-SDB-2020半干式轉印槽，購自美國Fisher Scientific公司；Model 1000分子雜交箱，購自美國Robbins Scientific Corporation；Soniprep 150超聲破碎儀，購自日本SANYO公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購自北京六一儀器廠。

1.1.3 主要試劑。限制性內切酶BamHI、XholI，PCR 擴增反應rTaq酶，蛋白分子量Marker和DNA分子量Marker，T4 DNA連接酶，皆購自于Takara公司；PagerulerPrestained蛋白分子量Marker，購自FERMENTAS公司。DNA凝膠回收及清潔試劑盒，購自Axygen公司；GST抗體及二抗，均購自南京金斯瑞生物技術有限公司；引物及測序均有南京金斯瑞生物有限公司進行。

1.2 方法

3 結論與討論

關于VDAC，以前人們更多的是集中在動物中VDAC功能的研究。隨著研究的深入，越來越多的人開始關注植物中的VDAC，并發(fā)現(xiàn)植物的VDAC蛋白在植物的生長與發(fā)育起到了十分重要的作用。Liu等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，VDAC3與AtKP1相互作用能夠調節(jié)種子在低溫萌發(fā)是的呼吸作用，Himmelbach， Yang等發(fā)現(xiàn)，VDAC與AtGluRS相互作用在ABA的信號轉導途徑中起到了重要的調節(jié)作用[13]。因此針對VDAC相互作用蛋白的研究對明確VDAC蛋白的功能是有非常重要的。同時，體外pulldown試驗通常需要可溶性的VDAC蛋白，但在VDAC蛋白的的研究中，外源表達VDAC蛋白時常會形成包涵體，因此需要通過復性操作以得到具有預期生物活性的蛋白質。而通常的包涵體復性過程中，復性條件難以控制，成本高，在復性過程中也很難保證包涵體蛋白形成正確的折疊結構。而如果能從上清較少的表達量中純化出可溶性的VDAC蛋白，則會避免這個問題。

實驗室前期采用pET30a（+）原核表達載體，構建了帶有組氨酸標簽的OsVDAC3融合蛋白的原核表達載體[14]。但是帶有組氨酸標簽的OsVDAC3融合蛋白幾乎都以包涵體的形式存在，幾乎不能純化出可溶性的帶有組氨酸標簽的OsVDAC3融合蛋白。因此試驗采用pGEX4T1原核表達載體，其在目標蛋白的N端加上一個約26 kD的GST標簽蛋白，在原核表達時得到了較pET30a（+）原核表達載體進行原核表達時更多的可溶型VDAC3蛋白，說明GST標簽可能具有增進原核表達蛋白可溶型的作用；也為進一步去研究OsVDAC3蛋白在水稻中的相關功能奠定了基礎。

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