林向飛等

[摘要]目的：本文旨在觀察沒食子兒茶素沒食子酸酯 （EGCG）對中波紫外線（UVB）引起的表皮HaCaT細(xì)胞損傷，以及對細(xì)胞著色性干皮病蛋白A（XPA）和切除修復(fù)互補(bǔ)交叉蛋白1（ERCC1）蛋白表達(dá)的影響。方法：以30mJ/cm2 UVB照射HaCaT細(xì)胞，照光前后加入50g/mL EGCG進(jìn)行干預(yù)，Western blot法檢測細(xì)胞XPA和ERCC1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：UVB照射后細(xì)胞內(nèi)XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平逐漸增高，在照光后4h達(dá)到峰值，后逐漸恢復(fù)至接近正常值；加入EGCG干預(yù)可明顯降低XPA和ERCC1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：EGCG對紫外線光損傷的干預(yù)作用可能與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)XPA和ERCC1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]UVB；HaCaT細(xì)胞；XPA；ERCC1；EGCG

[中圖分類號]R75 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）17-1401-03

Effects of EGCG on UVB induced the photodamage in HaCaT cells

LIN Xiang-fei1，MIN Wei2，ZHU Xiao-fang1，LUO Dan3

（1.Department of Dermatology，Clinic Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，Jiangsu，China；2.Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Soochow University；3.Department of Dermatology， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University）

Abstract： Objective To investigate the effects of EGCG on photodamage induced by UVB irradiation XPA and ERCC1 proteins expression in HaCaT cells. Methods HaCaT cells were irradiated with 30mJ/cm2 UVB.50 g/mL EGCG was added into the medium before or after UVB irradiation. Western blot assay was used to measure XPA and ERCC1 expression. Results 30mJ/cm2 UVB irriadiation increased the XPA and ERCC1expression which arrived at the peak at 4h after UVB irradiation.EGCG treatment significantly inhibited the XPA and ERCC1expression. Conclusion The effects of EGCG on UVB induced the photodamage in HaCaT cells maight be related with the inhibitory efficency of EGCG on XPA and ERCC1 expression.

Key words：UVB；HaCaT cell；XPA；ERCC1；EGCG

日光中的中波紫外線（UVB）是導(dǎo)致皮膚光損傷，如日曬傷及皮膚腫瘤發(fā)生的最重要的環(huán)境因素。UVB可引起表皮細(xì)胞DNA損傷和光產(chǎn)物形成，包括環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）和6-4光產(chǎn)物（（6-4）PPs）[1-2]。皮膚細(xì)胞可通過核苷酸切除修復(fù)（NER）機(jī)制等對上述DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，目前已知30多種基因參與NER過程[3-4]。大量研究證實(shí)綠茶多酚具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[5]。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明綠茶多酚主要活性成分EGCG對紫外線引起的皮膚細(xì)胞光損傷具有顯著抑制作用[6-8]。本研究將觀察EGCG對表皮HaCaT細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因產(chǎn)物XPA和ERCC1蛋白表達(dá)的影響，從而探討EGCG的光保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1主要試劑： RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；小牛血清（杭州四季清生物公司）；EGCG（Sigma公司，美國）；GAPDH、XPA和 ERCC1單克隆抗體（Abcam公司，美國）；PVDF膜（Millipore公司，美國）；ECL（Cell Signaling公司，美國）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)：在37 C、5% CO2條件下用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT 細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，以0.25%胰酶消化并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ mL，接種到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 UVB照射：以SUV-100日光紫外線模擬器（上海SIGMA技術(shù)有限公司）對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行照射，UVB劑量=UVB輻射度×?xí)r間（s），照射劑量為30mJ/cm2。

1.4EGCG干預(yù)處理：將HaCaT細(xì)胞等量接種于3.5cm培養(yǎng)皿中，于照光后0、1、2、4、8、12和24h收集細(xì)胞總蛋白。EGCG處理組分為照光前加藥干預(yù)及照光后加藥組，藥物孵育濃度為50 g/mL，于照光后4h收集細(xì)胞總蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測：分離提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。制備10%SDS-PAGE膠，加樣體積為20μl，40mA恒流電泳2h，100V恒壓電泳1h，PBST液洗滌PVDF膜5min/1次，加入一抗，37℃孵育2h；PBST液振蕩洗滌2次，加入二抗（1：200稀釋），37℃孵育20min；ECL顯色顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1UVB對XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平的影響：以30mJ/cm2UVB 照射HaCaT細(xì)胞，照光后0、1、2、4、8、12和24h收集細(xì)胞總蛋白，檢測XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平。與對照組相比，UVB照射后細(xì)胞內(nèi)XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平均明顯升高，在照光后4h達(dá)到最高值，隨后蛋白表達(dá)水平逐漸恢復(fù)至接近正常水平，但仍高于對照組（如圖1），與對照組相比，XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 EGCG對UVB引起的HaCaT細(xì)胞XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平的影響：將細(xì)胞分為對照組、EGCG非照光組、照光前加藥處理組、照光后加藥處理組及UVB組。于照光后4h收集蛋白， Western blotting檢測XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對照組相比， 單純EGCG處理對XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響；30mJ/cm2UVB照射可明顯升高細(xì)胞內(nèi)XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平，而在照光前或照光后加入EGCG干預(yù)均可顯著降低XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，如圖2）。

3 討論

人類皮膚是抵抗紫外線損傷的首要防線，其中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是 UVB作用的重要靶細(xì)胞。UVB輻射引起的表皮細(xì)胞DNA損傷和光產(chǎn)物產(chǎn)生主要通過NER過程進(jìn)行修復(fù)，NER機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄伴隨修復(fù)（TCR）和全基因組修復(fù)（GGR）兩種途徑，其主要步驟有：①識別損傷；②損傷DNA雙鏈解螺旋；③切除損傷部位；④移除包含損傷的DNA延伸鏈；⑤DNA再合成及連接。研究已證實(shí)NER過程中有包括XPA、ERCC1、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、p53等30多種基因產(chǎn)物參與其中。XPA特異性識別紫外線或化學(xué)性導(dǎo)致的DNA損傷，并且啟動(dòng)NER起始損傷識別步驟，穩(wěn)定在DNA損傷位置裝配的多蛋白修復(fù)復(fù)合體[9]。ERCC1對于損傷DNA的NER修復(fù)是必需基因[10]。EGCG是綠茶多酚中最主要和最有效的成分，并有抗突變、抗氧化、抗腫瘤形成、抗炎及調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物學(xué)效應(yīng)。我們在前期研究中業(yè)已證實(shí)EGCG對人皮膚細(xì)胞，包括角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有顯著的光保護(hù)效能。

本研究主要觀察了UVB和EGCG干預(yù)對細(xì)胞NER修復(fù)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白XPA和ERCC1表達(dá)的影響，籍此闡明皮膚細(xì)胞紫外線光損傷和EGCG光保護(hù)作用的分子機(jī)制。Western blotting檢測結(jié)果表明，和非照光組相比，30mJ/cm2UVB照射后，HaCaT細(xì)胞中XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平均逐漸升高，照光4h后逐漸恢復(fù)下降，這表明皮膚細(xì)胞經(jīng)受UVB損傷后，其DNA修復(fù)過程發(fā)生在照光后立即開始，在4h左右達(dá)到高峰并逐漸停止，如DNA損傷未能及時(shí)修復(fù)，將導(dǎo)致基因突變，甚至皮膚惡心腫瘤的發(fā)生。而單純加入EGCG與干預(yù)時(shí)，細(xì)胞XPA和ERCC1蛋白表達(dá)無明顯變化，這表明EGCG對皮膚細(xì)胞無損傷刺激作用。而在UVB照光前或照光后加入EGCG分別進(jìn)行干預(yù)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)UVB誘發(fā)的XPA和ERCC1蛋白表達(dá)水平增高情況均被明顯抑制。這些結(jié)果提示EGCG在照光前后進(jìn)行干預(yù)均能顯著抑制UVB輻射引起的細(xì)胞DNA損傷，從而表現(xiàn)為較弱的NER修復(fù)反應(yīng)過程。

總之， EGCG可在一定程度上抑制UVB誘發(fā)的皮膚細(xì)胞XPA和ERCC1蛋白表達(dá)，表明EGCG的光保護(hù)作用可能與調(diào)控上述蛋白表達(dá)有關(guān)。

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[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-31

編輯/何志斌