張立媛 高旭 陳海迪 于清洋 方爽

摘要 [目的]為分離犬細(xì)小病毒（CPV）。[方法]采集疑似CPV感染病死犬的組織病料，用胎貓腎細(xì)胞（F81）進(jìn)行病毒分離，并對(duì)分離的病毒進(jìn)行回歸動(dòng)物試驗(yàn)、間接免疫熒光（IFA）及VP2基因PCR擴(kuò)增鑒定。[結(jié)果]經(jīng)盲傳3代后F81出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變（CPE），分離病毒可導(dǎo)致2～3月齡犬出現(xiàn)典型犬細(xì)小病毒病（CP）的臨床癥狀和特征性病理變化，通過IFA觀察到特異性的綠色熒光，PCR擴(kuò)增到VP2基因全長為1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸。它與國內(nèi)外具有代表性的18株CPV VP2基因的核苷酸同源性為98.0%～99.8%，氨基酸同源性為96.1%～99.8%。[結(jié)論]用F81細(xì)胞成功分離到1株強(qiáng)毒CPV，命名為YBYJ株。

關(guān)鍵詞 犬細(xì)小病毒；VP2基因；分離鑒定；序列分析

中圖分類號(hào) S852.65+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09370-03

Isolation and Identification of Canine Parvovirus YBYJ and the VP2 Gene Sequence Analysis

ZHANG Liyuan， GAO Xu*， CHEN Haidi et al

（Department of Veterinary Medicine， Agricultural College， Yanbian University， Yanj， Jilini 133000）

Abstract [Objective] The research aimed to isolate a strain of canine parvovirus （CPV） from samples of canine which might be infected by CPV， and make the identification and sequencing analysis of VP2 gene. [Method] The typical tissues of diseased canine were collected from an affected canine in Yanji City， isolated by F81 cell， and identified as canine parvovirus （CPV） by experiment animals infection， IFA， HA and PCR. [Result] The test results showed that the virus was neutralized by standard positive serum against CPV and had cell lesions clearly on blind pass three generations. The canine parvovirus VP2 gene of the isolate was 1 755 bp encoding a protein of 548 amino acids， which shared 98.0% to 99.8% identity of nucleotide and 96.1% to 99.8% identity of nucleotide amino acid sequences with domestic and overseas reference strains， respectively. [Conclusion] A virulent strain of CPV was successfully isolated and named as YBYJ.

Key words Canine parvovirus； VP2 gene； Isolation and identification； Sequence analysis

犬細(xì)小病毒病（Canine parvovirus infection，CP）是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起犬的一種急性接觸性傳染病^[1]，臨床常表現(xiàn)高熱稽留、劇烈嘔吐、腹瀉等癥狀，病犬以急性出血性胃腸炎或心肌炎為主要病理變化。該病具有發(fā)病急、死亡率高等特點(diǎn)，給養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大的危害。1977年，Eugster和Naira在患出血性腹瀉病的犬糞便中首次發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒粒子；1978年，Kelly等^[2]從患腸炎的病犬體內(nèi)首次分離到CPV；1982年，梁士哲等^[3]首次報(bào)道我國存在CPV感染。此后，該病在世界各國家陸續(xù)發(fā)生，并將該病原體被命名為CPV2型，其與前期發(fā)現(xiàn)的犬微小病毒（Canine minute virus，CMV或CPV1型）在大小和形態(tài)上非常相似，但在宿主細(xì)胞嗜性和抗原性等方面存在顯著差異。近年來，由于CPVVP2基因的變異，使CPV2型毒株發(fā)生抗原漂移，原始毒株逐漸被新抗原突變株（CPV2a、CPV2b、CPV2c）取代^[4-5]。這種頻繁的抗原漂移導(dǎo)致異源疫苗難以預(yù)防地方株CPV感染。因此，分離到地方株CPV，用于疫苗研制是預(yù)防CP的有效手段。為此，筆者對(duì)延吉市疑似CPV感染病死犬進(jìn)行病料收集和體外病毒分離，在對(duì)CPVVP2基因進(jìn)行進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，對(duì)分離的病毒進(jìn)行分型鑒定，旨在為后期的CPV疫苗研制和分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

采集自延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院某疑似感染CPV死亡幼犬（2月齡）心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、腸內(nèi)容物等病料；CPV陽性血清由北京派克英生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞系及試驗(yàn)動(dòng)物

胎貓腎細(xì)胞（F81）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2～3月齡健康犬購于延吉市某養(yǎng)殖場（經(jīng)PCR與免疫膠體金試紙檢測均為CPV陰性）。

1.3 主要試劑

胎牛血清、青鏈霉素混合液、EDTA胰蛋白酶消化液、兔抗犬FITCIgG熒光抗體，均購自索萊寶生物技術(shù)有限公司；RPMI1640，購自Thermo公司；pMD18T vector、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I、Ex Taq DNA聚合酶、基因組DNA提取試劑盒，均購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購自O(shè)mega公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.4 病料處理及病毒分離

無菌采集疑似CPV感染犬心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)和腸內(nèi)容物等病料，將病料與PBS按照1∶4的比例混合，研磨制成勻漿，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，4 500 r/min離心30 min，上清液用0.22 μm濾膜濾過除菌后，接種于貼壁培養(yǎng)的F81細(xì)胞，孵育1 h，棄上清攻毒液，加入細(xì)胞維持液于37 ℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立未接種病料研磨液的F81細(xì)胞空白對(duì)照組。在接種后3～5 d將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，收集培養(yǎng)物，連續(xù)盲傳繼代培養(yǎng)，待F81細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)收毒。

1.5 間接免疫熒光（IFA）鑒定

在24孔板上，將病毒接種F81細(xì)胞，37 ℃、5%CO₂條件培養(yǎng)72 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，冷丙酮固定15 min，以CPV陽性血清為一抗，以兔抗犬FITCIgG為二抗，進(jìn)行IFA檢測。同時(shí)設(shè)置未接種病毒孔為陰性對(duì)照組。

1.6 病毒基因組提取與PCR鑒定

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的CPVVP2基因序列（JN867607）保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增特異引物，上游引物（1U28）：5ATAATATAATTTTCTAGGTGCTAG3（Xho I），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 755 bp，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min； 52 ℃ 1 min ；72 ℃ 2 min，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.7 病毒血凝（HA）試驗(yàn)及TCID50測定

收集第5代CPV病毒液，用1%豬紅細(xì)胞進(jìn)行HA試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。將第5代CPV培養(yǎng)液10倍倍比稀釋，取6個(gè)稀釋梯度（10¹～10⁶）分別接種96孔F81懸液，每孔100 μl，37 ℃、5% CO₂條件培養(yǎng)72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用ReedMuench方法計(jì)算TCID50。

1.8 病毒回歸試驗(yàn)

將8只2～3月齡健康犬隨機(jī)分為2組。試驗(yàn)組5只，口服細(xì)胞病毒（CPV）稀釋液，3 ml/只（104.5TCID50/只）；對(duì)照組3只，口服等量生理鹽水。每天觀察其臨床癥狀，記錄體溫。對(duì)試驗(yàn)組發(fā)病犬剖檢，觀察其病理變化。

1.9 基因測序與進(jìn)化分析

按照TaKaRa基因組提取試劑盒說明書提取CPV基因組，通過PCR擴(kuò)增將PCR產(chǎn)物克隆于pMD18T載體，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒。將PCR和酶切鑒定均正確質(zhì)粒送交上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，并使用DNAStar軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離與培養(yǎng)

將收集的疑似CPV感染病料10倍稀釋接種F81細(xì)胞。連續(xù)傳代，接種病毒3～5 d后可見心臟病料感染的F81細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞集聚、脫落、崩解和破碎，正常對(duì)照組F81細(xì)胞生長狀態(tài)良好，其他組織病料接種的F81細(xì)胞未出現(xiàn)明顯CPE（圖1）。

2.3 病毒血凝試驗(yàn)（HA）及TCID50測定結(jié)果

經(jīng)1%豬紅細(xì)胞進(jìn)行HA檢測，第5代CPV的HA效價(jià)為1∶256。采用ReedMuench方法計(jì)算病毒滴度，第5代CPV的TCID50為2×10⁶/ ml。

2.4 病毒回歸試驗(yàn)

以第5代CPV液感染2～3月健康犬，1周后試驗(yàn)組5只犬相繼出現(xiàn)明顯CP臨床癥狀，表現(xiàn)為可視黏膜蒼白、精神萎靡、嘔吐、發(fā)熱、腹瀉、聽診心內(nèi)有雜音明顯等癥狀，相續(xù)發(fā)生死亡，至第10天全部死亡。對(duì)病死犬進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，病理變化與自然感染死亡病例相似，可見心肌腫大、腸粘膜出血等病理特征，而空白對(duì)照組未見CP臨床癥狀，未出現(xiàn)死亡。

2.5 VP2基因測序與序列分析

測序結(jié)果表明，YBYJ株CPVVP2基因全長1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸，將YBYJ株

CPVVP2基因上傳至GenBank（KM014812）。經(jīng)序列分析，與GenBank中收錄的國內(nèi)外18株CPVVP2基因進(jìn)行比對(duì)，CPVVP2核苷酸序列同源性為98.0%～99.8%，氨基酸序列同源性為96.1%～99.8%，將其命名為YBYJ株。CPVVP2編碼的氨基酸進(jìn)化樹分析表明，YBYJ株VP2蛋白在氨基酸水平上與浙江（Zhejiang：EU213085）、陜西（Shanxi：JN403045）、哈爾濱（Harbin：JQ743906）、長春（Changchun：GU569936）分離株較近，而與印度（India：JN625224）、法國（France：DQ026002）、美國（USA：JN867607）分離株較遠(yuǎn)（圖4）。

3 結(jié)論與討論

吉林省延吉市地處延邊朝鮮族自治州，基于民族飲食的

特色，肉用犬需求量極大，但犬類烈性傳染病一直困擾著養(yǎng)犬業(yè)發(fā)展，由于犬類傳染病在犬之間傳播和流行迅速，短期內(nèi)造成全群感染，而且制約了大規(guī)模、集約化肉用犬的養(yǎng)殖。在諸多危害犬類健康的傳染性疾病中，以CPV感染最為常見，且危害較大，尤其在幼犬中傳染性極強(qiáng)，死亡率極高^[6]。因此，采用有效疫苗進(jìn)行免疫接種是保證養(yǎng)犬業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。

目前，世界范圍流行的致病毒株多為CPV2型，病毒含3個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別為VP1、VP2和VP3，其中VP2基因編碼病毒衣殼蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，VP2基因常發(fā)生突變，導(dǎo)致了病毒的抗原漂移，使原始CPV2型毒株逐漸被新的抗原突變株取代（CPV2a、CPV2b和CPV2c）^[7-9]，由于CPV2型毒株的快速突變，目前臨床上使用的弱毒疫苗和滅活疫苗多數(shù)不具有針對(duì)性，而使免疫效果不夠理想。因此，各地區(qū)亟需分離到地方性CPV株，用于疫苗的研制，有效預(yù)防當(dāng)?shù)谻PV的傳播和蔓延。筆者從延吉市疑似CPV感染病死犬采集病料，分離到Y(jié)BYJ株CPV。在病毒分離過程中，嘗試采用MDCK和F81細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，其中MDCK細(xì)胞分離組盲傳數(shù)代未見明顯CPE，經(jīng)鑒定為分離病毒失敗；采用F81細(xì)胞分離組，在盲傳3代后發(fā)現(xiàn)心臟病料感染F81細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，其他病料感染組F81細(xì)胞CPE不明顯，通過PCR、IFA和HA等試驗(yàn)鑒定，發(fā)現(xiàn)心臟病料感染組為CPV陽性，而其他病料組均為CPV陰性。結(jié)果表明，該試驗(yàn)中F81細(xì)胞更利于CPV的分離，對(duì)于心肌炎型CP采取心臟病料進(jìn)行病毒分離是首選，這也與該病犬生前臨床診斷為心肌炎型CP相符。通過回歸動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種CPV的5只犬均發(fā)生死亡，證明該分離病毒為CPV強(qiáng)毒。

為VP2蛋白的第426位氨基酸為Asn（N）的CPV2型屬于CPV2a亞型，這也得到了其他研究人員的一致認(rèn)可^[7-9]。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，YBYJ株CPV的第426位氨基酸為Asn（N），所以將其界定為CPV2a亞型，屬于我國目前流行病毒株（CPV2a、CPV2b和CPV2c）范疇。因此，筆者成功分離到1株CPV（YBYJ株），該病毒為CPV2a亞型，屬于強(qiáng)毒，成功克隆CPVVP2基因，為下一步CPV疫苗研制和服務(wù)地方養(yǎng)犬業(yè)奠定了基礎(chǔ)。

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