邢秋婷 郭興國 邢萬靜 闞云超 喬惠麗

摘要 [目的] 研究家蠶Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蠶幼蟲中的表達(dá)情況。[方法] 根據(jù)家蠶基因組預(yù)測(cè)的BmSu（z）12基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用qRTPCR對(duì)該基因在家蠶不同齡期幼蟲中的表達(dá)進(jìn)行研究。[結(jié)果] BmSu（z）12基因在5齡幼蟲蛻皮后2 d和變態(tài)前2 d有較高表達(dá)，而在1～5齡取食中期表達(dá)量較低，表達(dá)特征具有一定的規(guī)律性。 [結(jié)論] BmSu（z）12基因在家蠶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，該研究為進(jìn)一步研究家蠶SU（Z）12蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 家蠶；polycomb蛋白；Su（z）12基因；表達(dá)

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09286-02

Study on Expression of Polycomb Group Gene BmSu（z）12 in Silkworm Larvae.

XING Qiuting， GUO Xingguo， XING Wanjing， QIAO Huili et al

（Henan Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Mountain， Nanyang Normal University， Nanyang， Henan 473061）

Abstract [Objective] The aim was to study the expression of polycomb group gene BmSu（z）12， in silkworm larvae. [Method] Based on the predicted BmSu（z）12 gene sequence in the genome of silkworm， the specific primers were designed. qRTPCR was applied to analyze the expression of BmSu（z）12 in different instar larvae of silkworm. [Result] The expression level of BmSu（z）12 was high in the first and the last 2 days of the 5th newly molted larvae， low expression was observed in the eating larvae of each instar. It showed regular expression patterns in the different developmental stages of larva. [Conclusion] BmSu（z）12 may have important roles in the development of the silkworm larvae， the study will provide fundamental knowledge for further investigation of SU（Z）12 protein function in silkworm.

Key words Silkworm； Polycomb protein； Su（z）12 gene； Expression

Polycomb蛋白復(fù)合體（Polycomb Group Proteins，PcG）是通過對(duì)組蛋白進(jìn)行甲基化修飾來調(diào)控靶基因的表觀遺傳調(diào)控因子，廣泛存在于果蠅、線蟲、小鼠、人和擬南芥等各種生物體中，在進(jìn)化上高度保守。PcG蛋白家族最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，主要包含2個(gè)核心蛋白復(fù)合體，即PRC1（Polycomb Repressive Complex 1）和PRC2（Polycomb Repressive Complex 2），其中PRC2在轉(zhuǎn)錄抑制起始階段發(fā)揮作用，PRC1主要維持處于阻抑狀態(tài)染色質(zhì)的穩(wěn)定性^[1-4]。

在果蠅中，PRC1是由PC、PH、PSC和dRing組成的一個(gè)蛋白復(fù)合體，PRC2主要包括ESC、E（Z）、Rpd3、SU（Z）12和組蛋白結(jié)合蛋白p55/RbAp48^[5-6]。在哺乳動(dòng)物中，PRC1由HPC、HPH、Bmi1/Mel18和Ring1A/B組成，PRC2由EED、EZH2、SU（Z）12、RbAp48和AEBP2組成，其中PRC2催化核心組蛋白的甲基化，而甲基化的組蛋白為PRC1復(fù)合體識(shí)別和結(jié)合提供位點(diǎn)^[7]。

近年來，PcG蛋白作為轉(zhuǎn)錄水平上的表觀遺傳修飾因子和細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)子受到越來越多研究者的關(guān)注。在生物生長(zhǎng)發(fā)育和病變過程中，PcG蛋白通過形成多復(fù)合體，作用于染色體上的不同位點(diǎn)，致使染色體變構(gòu)，以期調(diào)控基因表達(dá)^[8]。PcG蛋白的主要作用靶標(biāo)是Hox基因簇，Hox基因在決定細(xì)胞的定向分化與增殖、調(diào)控機(jī)體組織器官發(fā)育方面起決定性作用。其中PRC2主要參與H3K27的甲基化修飾來抑制靶基因的表達(dá)，而SU（Z）12是PRC2蛋白復(fù)合體發(fā)揮其內(nèi)在的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methyltransferase，HMTase）活性所必需的成分之一，其VEFS結(jié)構(gòu)域在果蠅、人和擬南芥中高度保守，目前發(fā)現(xiàn)SU（Z）12在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控中起著極其重要的作用^[9-12]。

家蠶作為人類最早馴化的動(dòng)物之一，是我國重要的特色經(jīng)濟(jì)昆蟲，且作為鱗翅目昆蟲的模式生物，在研究昆蟲變態(tài)發(fā)育及農(nóng)林業(yè)害蟲防治中也發(fā)揮著重要作用，同時(shí)家蠶具有大量的Hox基因。筆者根據(jù)家蠶基因組中預(yù)測(cè)的BmSu（z）12基因序列，利用PCR法對(duì)家蠶BmSu（z）12基因VEFS結(jié)構(gòu)域進(jìn)行克隆，并利用qRTPCR研究BmSu（z）12在家蠶不同齡期幼蟲的表達(dá)情況，從而為進(jìn)一步研究家蠶中BmSu（z）12的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以家蠶品種大造P50作為試驗(yàn)材料，用新鮮的桑葉飼養(yǎng)。分別取1～4齡幼蟲和5齡每天的整蠶，解剖去中腸并用DEPC水沖洗。所有樣品迅速置于無RNA酶的離心管中，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物

PCR擴(kuò)增所用引物序列（5′～3′）BmSu（z）12F：GAGTTCCTAGAGCTGGACGA；

BmSu（z）12R：GAGCATCTGAACGGTCT；

BmactinA3F：ATGTGCGACGAAGAAGTTGC；

BmactinA3R：GTCTCCTACGTACGAGTCCT。由奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 家蠶幼蟲RNA提取及BmSu（z）12基因克隆

采用Trizol（Invitrogen）法，提取家蠶幼蟲整蠶樣品RNA，利用PrimeScript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

根據(jù)家蠶基因組中預(yù)測(cè)的BmSu（z）12基因序列BGIBMGA011842PA設(shè)計(jì)引物。以家蠶5齡第1天幼蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19T simple連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）DH5α，挑取陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 BmSu（z）12基因在不同齡期幼蟲中表達(dá)的qRTPCR分析

qRTPCR檢測(cè)的內(nèi)參基因?yàn)榧倚QBmactinA3（GenBank登錄號(hào)：U49854）。BmactinA3和BmSu（z）12引物序列見“1.2”。反應(yīng)檢測(cè)儀為BioRad 公司的CFX96系統(tǒng)，qRTPCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線在65 ～95 ℃用來判定產(chǎn)物特異性。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，BmSu（z）12基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△CT表示，其中△Ct=Ct（目的基因）- Ct（內(nèi)參基因）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmSu（z）12基因片段的克隆

通過PCR方法，從家蠶幼蟲RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA中克隆BmSu（z）12基因423 bp的片段，產(chǎn)物經(jīng)奧科公司測(cè)序正確，表明為目的基因。

2.2 BmSu（z）12基因在家蠶幼蟲不同時(shí)期的表達(dá)分析

采用qRTPCR方法對(duì)BmSu（z）12在家蠶不同齡期幼蟲的表達(dá)情況進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，BmSu（z）12基因在家蠶1～4齡的幼蟲中表達(dá)量較低，而在5齡各時(shí)期樣品中的表達(dá)量相對(duì)較高，并呈一定的規(guī)律。在剛蛻皮后的5齡第1天、第2天和進(jìn)入變態(tài)前的5齡第7天、第8天表達(dá)量較高，而在5齡中期（第3、4、5、6天）的表達(dá)量較低。

3 討論

PcG蛋白家族通過催化組蛋白H3的27位賴氨酸的甲基化水平來調(diào)控靶基因表達(dá)，并廣泛參與到發(fā)育、增殖、分化及腫瘤發(fā)生等重要的生命過程。SU（Z）12本身沒有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但其對(duì)PRC2復(fù)合體的功能具有重要作用。研究表明，在過表達(dá)SU（Z）12的果蠅突變體中可以檢測(cè)到H3K27me3的甲基化程度明顯增加，而敲除SU（Z）12的突變體中H3K27me3完全消失^[13]。該試驗(yàn)在家蠶幼蟲中克隆獲得PcG蛋白PRC2復(fù)合體中的重要組分BmSu（z）12基因的VEFS結(jié)構(gòu)域，將其編碼氨基酸序列與其他物種的同源序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與果蠅和人類Su（z）12分別有72%和52%的序列相似性。BmSu（z）12家蠶幼蟲的qRT PCR結(jié)果顯示，BmSu（z）12基因在5齡幼蟲中蛻皮后2 d和變態(tài)前2 d表達(dá)量較高，而在1～5齡取食中期表達(dá)量較低，該表達(dá)特征具有一定的規(guī)律性。因?yàn)樵谟紫x蛻皮后和變態(tài)前家蠶各組織都處于組織重構(gòu)狀態(tài)，新的組織細(xì)胞將準(zhǔn)備進(jìn)行分化；而到取食中期，家蠶體內(nèi)組織功能回歸正常，分化過程放緩，表明BmSu（z）12基因在家蠶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅SU（Z）12突變體中發(fā)現(xiàn)果蠅產(chǎn)下的卵不能正常發(fā)育^[13]；家蠶中Su（z）12在胚胎發(fā)育早期大量表達(dá)，晚期逐漸降低^[14]，表明該蛋白在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮功能；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中敲除SU（Z）12后導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變小，進(jìn)一步表明SU（Z）12可能在細(xì)胞分化中發(fā)揮作用^[15]；最近的研究發(fā)現(xiàn)，Su（z）12在不同人類腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，因此可能是一種新的腫瘤基因治療的分子靶點(diǎn)^[16-18]。家蠶屬于完全變態(tài)發(fā)育昆蟲，幼蟲期每個(gè)齡期之間都要經(jīng)歷眠和蛻皮的過程，不同階段發(fā)育過程中細(xì)胞的重組和分化都非常重要。因此通過對(duì)BmSu（z）12在幼蟲中表達(dá)特征的研究，將為進(jìn)一步研究家蠶SU（Z）12蛋白的功能提供理論依據(jù)。

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