李戰(zhàn)　農(nóng)曉琳　李佳荃等

[摘要]目的：研究青蒿琥酯（ART）抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的果蠅抗皮膚生長(zhǎng)因子原體3（Smad3）的表達(dá)。方法：原代培養(yǎng)人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，以濃度為0，75，150，300，600μmol/L ART分別干預(yù)24h。熒光定量RT-PCR法檢測(cè)其Smad3 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)其Smad3蛋白表達(dá)。結(jié)果：各濃度ART作用于成纖維細(xì)胞后，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA表達(dá)下調(diào)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組Smad3蛋白表達(dá)下調(diào)，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。結(jié)論：ART能下調(diào)人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Smad3的mRNA及蛋白水平，通過(guò)抑制Smad3的表達(dá)從而減少膠原合成可能是ART抑制增生性瘢痕的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；青蒿琥酯；Smad3

[中圖分類號(hào)]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）04-0295-04

皮膚增生性瘢痕是臨床上常見(jiàn)的疾病，常不同程度地影響患者的容貌和功能，治療棘手。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，由多種原因所致的以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過(guò)度增殖、多種致纖維化因子過(guò)度表達(dá)、以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積及降解減少，導(dǎo)致增生性瘢痕的形成[1]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)將青蒿琥酯作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)在一定劑量?jī)?nèi)可以明顯抑制成纖維細(xì)胞的增生，并誘導(dǎo)其凋亡[2]；通過(guò)兔耳瘢痕模型同樣證實(shí)其有明顯的抑制瘢痕增生作用[3]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，采用不同濃度的青蒿琥酯干預(yù)，檢測(cè)其對(duì)成纖維細(xì)胞Smad3的基因及其蛋白的表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討青蒿琥酯對(duì)皮膚增生性瘢痕的抑制作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1試劑和儀器：青蒿琥酯（純度99.99%，桂林南藥股份公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），TS-100F型熒光倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司），NanoDrop 2000超微量分光光度（Thermo公司）、Step-one plus型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），RNA提取試劑盒RNAiso Plus、PCR引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），鼠抗人Smad3單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）， 鼠抗人β-actin單克隆抗體（上海康成公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本來(lái)源：無(wú)菌條件下切取4例廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科增生性瘢痕病例標(biāo)本（經(jīng)臨床及病理證實(shí)），病程3～6月，取材前經(jīng)患者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)為近2年內(nèi)未接受瘢痕治療，無(wú)系統(tǒng)疾病者。

1.2.2 原代培養(yǎng)：采用組織塊法原代培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞[4]，培養(yǎng)液為含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，按1：3反復(fù)傳代純化成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)使用第3～5代細(xì)胞。

1.2.3 熒光定量RT-PCR法測(cè)定Smad3的mRNA表達(dá)：按5×105/ml的細(xì)胞密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，換用含藥培養(yǎng)基，干預(yù)24h，提取各組細(xì)胞總RNA，NanoDrop 2000 測(cè)定RNA濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行SYBR標(biāo)記熒光定量PCR。委托TAKARA公司引物設(shè)計(jì)及合成引物，并于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST驗(yàn)證，引物序列為：目的基因Smad3上游引物5'-CCAGGGCTTTGA GGCTGTCTA-3'，下游引物5'-GCAAAGGCCCATTCAG GTG-3'（143bp）；選擇GAPDH作為內(nèi)參，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGC TGAGAAC-3'，下游引物5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'（138bp）。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為SYBR R Premix Ex TaqTM 10μl，上游引物 0.4μl，下游引物 0.4μl，ROX 0.4μl，去離子水6.8μl，cDNA 2μl，總共20μl；擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s→95℃變性5s→60℃退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法表示Smad3的相對(duì)表達(dá)量?！鰿t=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），△△Ct=△Ct（干預(yù)組）-△Ct（空白對(duì)照組）。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)Smad3的蛋白表達(dá)：采用上述不同濃度的青蒿琥酯干預(yù)后，冰上裂解細(xì)胞，離心收集總蛋白，常規(guī)Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及抗體孵育（一抗稀釋比例為1：500，4℃過(guò)夜），ECL化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。Image J軟件分析比較Smad3條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多樣本間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析SNK-q檢驗(yàn)，取P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)5～7天可見(jiàn)組織塊周?chē)屑?xì)小呈長(zhǎng)梭狀貼壁細(xì)胞爬出（圖1A），之后梭形細(xì)胞增殖迅速，15～20天可長(zhǎng)滿25cm2培養(yǎng)瓶（圖1B），經(jīng)傳代3次后即可獲得呈旋渦狀的較純的成纖維細(xì)胞（圖1C）。

2.2 青蒿琥酯對(duì)Smad3 mRNA表達(dá)的影響：Smad3基因和內(nèi)參基因GAPDH的各曲線如圖顯示（圖2A，圖2B），擴(kuò)增曲線的基線平整，指數(shù)區(qū)明顯，單峰溶解曲線證明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，說(shuō)明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Smad3具有較好的敏感性和準(zhǔn)確性。2-△△Ct法分析發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組Smad3的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ART 300μmol/L與ART 600μmol/L組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），其余各ART組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.3 青蒿琥酯對(duì)Smad3蛋白的表達(dá)的影響：免疫印跡法檢測(cè)成纖維細(xì)胞Smad3蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值結(jié)果顯示，各干預(yù)組Smad3蛋白表達(dá)明顯下降，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ART 75μmol/L組與ART 150μmol/L組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），余各ART組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3，表2。

3 討論

皮膚增生性瘢痕是臨床常見(jiàn)的難治性纖維化疾病，其特征為成纖維細(xì)胞過(guò)度增生和細(xì)胞外基質(zhì)異常堆積。治療增生性性瘢痕常用的措施主要包括：手術(shù)切除、冷凍、激光、放療、瘢痕內(nèi)注射藥物等[1]。中藥對(duì)增生性瘢痕的防治有著久遠(yuǎn)的歷史，對(duì)其機(jī)制也有獨(dú)特的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為它主要有氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻所致，治療上主要是活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為主。在目前缺乏更有效的抗增生性瘢痕藥物的情況下，將相對(duì)低毒的中藥應(yīng)用于預(yù)防增生性瘢痕，不失為一種選擇[5]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，研究表明，青蒿琥酯可抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡[6]，且對(duì)多種纖維化疾病均有抑制作用[7]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transformation growth factor-β1，TGF-β1）是目前已知的最強(qiáng)的促增生性瘢痕形成因子[8]。TGF-β1主要通過(guò)膜受體經(jīng)胞內(nèi)信號(hào)分子將信號(hào)從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)而發(fā)揮作用。Smad蛋白家族是TGF-β受體家族（TGF-βR）的底物，當(dāng)TGF-β與其胞膜受體形成配體-受體復(fù)合物時(shí)，可以磷酸化絲氨酸/蘇氨酸相關(guān)激酶，激活Smads蛋白向細(xì)胞核內(nèi)發(fā)出信號(hào)，介導(dǎo)核內(nèi)靶基因的調(diào)節(jié)。Smads蛋白分子根據(jù)其功能和特征的不同分為受體調(diào)節(jié)型（Smad1，Smad2，Smad3等）、共同通路型（Smad4）、抑制型（Smad6， Smad7）[9]。作為受體調(diào)節(jié)型Smads的一員，Smad3在與瘢痕發(fā)生發(fā)展相關(guān)的TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用；TGF-β1通過(guò)激活Smad3信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、趨化以及加快胞外基質(zhì)的沉積，抑制該通路則可以發(fā)揮抑制瘢痕的作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用青蒿琥酯作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，將Smad3作為青蒿琥酯作用于成纖維細(xì)胞后的檢測(cè)因子，發(fā)現(xiàn)Smad3在基因及蛋白水平均隨藥物濃度增加表達(dá)降低，并在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性。因此我們推測(cè)，青蒿琥酯可能通過(guò)抑制增生性瘢痕組織中Smad3的表達(dá)，導(dǎo)致Smad3介導(dǎo)的、由TGF-β1與受體結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)的作用減弱，從而使纖維細(xì)胞合成膠原蛋白減少，避免過(guò)量纖維組織形成，進(jìn)而抑制瘢痕增生進(jìn)程。本研究有助于明確中藥抗瘢痕增生的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)利用中藥治療增生性瘢痕提供了一定的依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Gauglitz GG， Korting HC， Pavicic T， et al. Hypertrophic Scarring and Keloids： Pathomechanisms and Current and Emerging Treatment Strategies[J].Mol Med，2011，17（1-2）：113-125.

[2]農(nóng)曉琳，陳洪，陳石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮膚瘢痕的研究[J].中華皮膚科雜志，2009，42（6）：421-424.

[3]農(nóng)曉琳，陳洪，陳石海，等.青蒿素、青蒿琥酯抗皮膚瘢痕的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（2）：202-5.

[4]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安： 世界圖書(shū)出版公司， 2007：58-59.

[5]胡麗，李偉.增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)理和預(yù)防進(jìn)展[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2013（05）：607-610.

[6]Li-Weber M.Targeting apoptosis pathways in cancer by Chinese medicine[J].Cancer Lett，2013，332（2）：304-312.

[7]陳翔，農(nóng)曉琳.青蒿琥酯治療病理性瘢痕與纖維化疾病機(jī)制[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013（05）：633-636.

[8]Penn JW，Grobbelaar AO， Rolfe KJ. The role of the TGF-β family in wound healing， burns and scarring：a review[J].Int J Burn Trauma，2012，2（1）：18-28.

[9]李薈元，魯開(kāi)化，郭樹(shù)忠.新編瘢痕學(xué)[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2003：201-204.

[10]Hsu YC，Chen MJ，Yu YM，et al.Suppression of TGF-beta1/SMAD pathway and extracellular matrix production in primary keloid fibroblasts by curcuminoids： its potential therapeutic use in the chemoprevention of keloid[J].Arch Dermatol Res，2010，302（10）：717-724.

[收稿日期]2013-11-25 [修回日期]2014-01-22

編輯/張惠娟