華宇峰　劉京　王春臺　劉學(xué)群　譚艷平

摘要[目的]通過基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）中的2個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79的RNA，為Northern Blot檢測提供陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品，并可作為凝膠阻滯試驗(yàn)的底物，用于研究與恢復(fù)基因編碼產(chǎn)物的相互作用，從而為闡釋不育基因與恢復(fù)基因的相互作用分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]以紅蓮型胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79的特異引物，利用不育系YTA為材料，PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段，分別連接至pGEM-T Easy質(zhì)粒并篩選陽性重組質(zhì)粒，測序鑒定后酶切線性化，補(bǔ)平粘性末端，以rN4為底物、用依賴于DNA的 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase處理除去DNA模板，純化并測定RNA濃度，并用Northern Blot 驗(yàn)證。[結(jié)果]獲得了細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA，經(jīng)檢測orf216濃度為1.286 μg/μl，A260/A280為2.01；orfH79濃度為1.006 μg/μl，A260/A280為2.10。[結(jié)論]運(yùn)用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得的RNA片段條帶單一，純度較高，可用于體外大量獲取目的RNA。

關(guān)鍵詞水稻；紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育；體外轉(zhuǎn)錄；Northern Blot

中圖分類號S511；Q37文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03497-02

基金項(xiàng)目國家自然基金項(xiàng)目（31170296）。

作者簡介華宇峰（1988- ），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)研究。*通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事水稻功能基因方面的研究工作。

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic Male Sterile，CMS）現(xiàn)象在高等植物中普遍存在，是指植物雄性器官喪失功能，而雌性器官發(fā)育正常，表現(xiàn)為母性遺傳和花粉敗育的生物學(xué)現(xiàn)象[1]。Levings最早報(bào)道玉米CMS與細(xì)胞質(zhì)的線粒體基因組異常有關(guān)，并以此提出線粒體DNA是導(dǎo)致CMS產(chǎn)生的載體[2]。在大多數(shù)情況下，CMS植株花粉敗育的發(fā)生與線粒體基因組分子內(nèi)或分子間頻繁重組所形成的嵌合基因有關(guān)[3]，這種線粒體基因組的非正常重組產(chǎn)生嵌合開放閱讀框最終導(dǎo)致了花粉敗育[4]。CMS導(dǎo)致的花粉敗育可以被恢復(fù)基因Rf所恢復(fù)。CMS/Rf系統(tǒng)減少了手工去雄的工作程序，因此，其在商業(yè)用雜交種子生產(chǎn)過程中就顯得尤為重要。CMS除了在農(nóng)業(yè)上的重要性之外，研究CMS的特性也為解析植物中線粒體基因和核基因在遺傳上的相互作用帶來了方便。

Boro II（BT）、Honglian（HL）和Wild abortive（WA）是主要的3種胞質(zhì)雄性不育類型，均用于三系雜交水稻的培育[5]。易平等以atp6為探針，采用同源系列法，證明了HLCMS線粒體基因組中atp6orfH79構(gòu)成的嵌合基因與CMS有關(guān)[6]。liu等克隆了一個(gè)與HLCMS相關(guān)的基因片段HLsp1[7]。李丕順通過TAILPCR獲得HLsp1側(cè)翼序列，并預(yù)測其下游有一個(gè)編碼216個(gè)氨基酸的開放閱讀框orf216[8]。陳為等發(fā)現(xiàn)orf216的表達(dá)能導(dǎo)致花粉敗育[9]。

體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是在體外條件下合成RNA的過程。其基本原理是將目的基因片段連接到帶有噬菌體啟動子的克隆載體下游，以構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA或其線性化片段為模板，用依賴于DNA的RNA聚合酶，在4種核糖核酸存在條件下，體外轉(zhuǎn)錄生成目的RNA?，F(xiàn)已成為一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于制備RNA，目前已經(jīng)有商業(yè)化的試劑盒銷售。應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄體系合成的單鏈RNA可用于研究RNA的加工、RNA結(jié)構(gòu)特性及其翻譯；還可用于合成RNA雜交探針，靈敏度極高，特異性強(qiáng)，優(yōu)于切口平移法獲到的探針[10]。筆者通過基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，獲得水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）中的2個(gè)雄性不育基因orf216和orfH79各自對應(yīng)的mRNA，以期為進(jìn)一步研究orf216的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。HLCMS不育系YTA植株和大腸桿菌DH5α，均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，克隆載體pGEMT Easy Vector，購自Promega公司。

1.1.2主要試劑。限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker和T4 DNA連接酶，購自TAKARA公司；T4 DNA 聚合酶，購自碧云天公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen公司；SP6 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Promega公司；North2South？Biotin Random Prime Labeling Kit、North2South Chemiluminescent Hybridization和Detection Kit，均購自Thermo scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)試劑分析純，市售。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)[6]。根據(jù)易平等發(fā)表的orfH79序列設(shè)計(jì)引物orfH79F/orfH79R，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室克隆的orf216序列設(shè)計(jì)引物orf216F/orf216R。引物由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2載體構(gòu)建。取新鮮的水稻YTA葉片，用CTAB法提取基因組DNA，分別用orfH79和orf216的序列引物擴(kuò)增基因組DNA，獲得orfH79和orf216目的片段。將片段分別與克隆載體pGEMT Easy Vector 在體外進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于藍(lán)白斑篩選平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，SDS堿裂解法提取培養(yǎng)菌株質(zhì)粒DNA，并用PCR擴(kuò)增檢測其是否為陽性，檢測為陽性者送南京金斯瑞公司測序驗(yàn)證。

1.2.3體外轉(zhuǎn)錄。用限制性內(nèi)切酶NcoI將測序正確的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 聚合酶將粘性末端補(bǔ)平，再一次純化，得到可用于體外轉(zhuǎn)錄的線性質(zhì)粒DNA。按照SP6 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制體外轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，用RNasefree DNase消化模板質(zhì)粒DNA，純化產(chǎn)物，分別得到orfH79 mRNA和orf216 mRNA。nano drop儀（Thermo scientific公司，Nano Drop 2000）測定RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA產(chǎn)物。

1.2.4Northern Blot檢測。應(yīng)用Northern Blot方法，利用生物素標(biāo)記的寡聚核苷酸作為探針，檢測所得到的RNA是否為特異的目標(biāo)RNA。

2結(jié)果與分析

2.1載體構(gòu)建以水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）為材料，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別得到orfH79和orf216目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對質(zhì)粒DNA進(jìn)行特異引物PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果為陽性者送南京金斯瑞公司測序，測序結(jié)果均正確。

3討論

基因的體外轉(zhuǎn)錄體系現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于RNA的制備。通過體外轉(zhuǎn)錄，可以獲得多種RNA，包括SiRNA、tRNA及其他類型的RNA，用于研究基因的表達(dá)調(diào)控，以及研究RNA的結(jié)構(gòu)和功能等。