高志暉等

摘要[目的]確定白木香愈傷組織與葉片DNA的快速提取方法。[方法]用TE、ES1、ES2 3種提取液及相應(yīng)的方法提取葉片和愈傷組織總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取產(chǎn)物，通過普通PCR及熒光定量PCR檢查DNA的可用性，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證。[結(jié)果]ES1法提取的葉片和愈傷DNA條帶清晰，純度較高；普通PCR和熒光定量PCR可擴(kuò)增出200和600 bp左右的目的條帶。ES2法提取液電泳不能檢測(cè)到DNA條帶，但PCR可擴(kuò)增出愈傷組織200 bp左右目的條帶。TE法得到的提取液檢測(cè)不到DNA條帶且PCR不能得到目的條帶。[結(jié)論]ES1提取液及相應(yīng)的提取方法可用于白木香愈傷和葉片DNA高通量快速提取，為沉香屬植物種質(zhì)研究和分子研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞瀕危南藥；白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]；DNA快速提??；沉香；葉片；愈傷

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）14-04194-03

Determination of the Qualified Rapid-DNA-Extraction Method from Callus or Leaves of Aquilaria sinensis

GAO Zhihui，WEI Jianhe et al（Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100193； Hainan Key Lab of SouthChina Medicine Resource Protection and Development，Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development of Chinese Academy of Medical Science，Wanning，Hainan 571533）

Abstract[Objective] To determine the rapid DNA extraction method from calli or leaves of Aquilaria sinensis. [Method] We tested three methods （TE，ES1，ES2） used in Arabidopsis and rice for rapid DNA extraction from leaves and calli of A.sinensis. The extracted products were evaluated through agarose gel electrophoresis，PCR and realtime PCR reactions.The amplicons were further confirmed by clone and sequencing.[Result] The extraction method using solution ES1 could successfully isolate total DNA from leaves and calli of A.sinensis in 20 min：agarose gel electrophoresis showed clear binds.The DNA was qualified for PCR amplification of ～200 bp or ～600 bp sequences.The extracted product from calli using solution ES2 can also amplify the ～200 bp sequence，but failed to amplify the ～600 bp sequence.Other methods were failed to extract DNA and amplify any sequences.[Conclusion] The method using ES1 solution is qualified for rapid DNA isolation from A.sinensis for PCR amplification，which will lay a foundation for Aquilaria plants germplasm and molecular research.

Key wordsEndangered southChina medicine； Aquilaria sinensis； DNA rapid extraction； Agarwood； Leaves； Callus

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]又稱土沉香，屬瑞香科沉香屬植物，為我國(guó)特有的熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國(guó)生產(chǎn)名貴芳香類藥材沉香的唯一植物來源。由于沉香的高價(jià)值（目前特級(jí)沉香塊國(guó)際成交價(jià)高達(dá)10 000美元/kg）且國(guó)際市場(chǎng)需求極大，長(zhǎng)期以來白木香遭到掠奪式過度砍伐，其原始林已經(jīng)基本破壞殆盡。1999年白木香被列為國(guó)家2級(jí)瀕危保護(hù)植物并收載于《中國(guó)植物紅皮書》。2000年白木香被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》[2]。2004年白木香列入了《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES，即華盛頓公約）附錄，同時(shí)產(chǎn)于東南亞等各國(guó)生產(chǎn)沉香的沉香屬所有植物均列入了該公約名錄。沉香主要形成于白木香樹干心材部位。然而，健康的白木香不能形成沉香，只有在受到傷害、病菌侵染等脅迫時(shí)才會(huì)合成沉香類化學(xué)成分，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間積累后形成沉香[3-7]。為保護(hù)沉香資源，建立高效、穩(wěn)定的結(jié)香技術(shù)體系滿足市場(chǎng)需求，亟需利用現(xiàn)代生物技術(shù)和分子生物學(xué)研究手段尋找高效結(jié)香優(yōu)良種質(zhì)，解析清楚沉香誘導(dǎo)結(jié)香的分子機(jī)制，為建立高效結(jié)香技術(shù)提供依據(jù)和思路。其中DNA提取方法是分子研究的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的植物DNA提取方法如CTAB法[8]、SDS[9]法等雖可獲得的DNA純度較高、產(chǎn)量大，但往往程序繁瑣，用時(shí)較長(zhǎng)，加上一次提取樣品量有限，不能滿足種質(zhì)鑒定和轉(zhuǎn)基因植株等分子鑒定的需求。故而尋找一種快速有效的簡(jiǎn)易DNA提取方法十分必要。目前，已有擬南芥、水稻、小麥、番茄、油菜、柑橘、松樹等多種植物開發(fā)建立了各自適用的快速DNA提取方法，以用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)以及SSR、ISSR等分子標(biāo)記擴(kuò)增[10-15]。筆者考察白木香愈傷組織與葉片DNA的快速提取方法，以期為白木香的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。白木香葉片，取自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所溫室種植的3年生白木香（A.sinensis）。

1.1.2主要儀器。天根電動(dòng)組織研磨器和Sigma 114高速離心機(jī)，購自Sigma公司；Thermo CR3i高速冷凍離心機(jī)，購自Thermo公司；BioRad凝膠成像系統(tǒng)、BioRad PowerPac電泳儀、Biometra PCR儀和BioRad IQ5熒光定量PCR儀，均購自BioRad公司。

1.1.3主要試劑。SDS（十二烷基磺酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris、NaCl、KCl和異丙醇，均購自北京化學(xué)試劑公司；SYBR Green熒光定量PCR酶、Extaq酶和pMD18TSimple載體，均購自寶生物公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒，購自天根生化公司。

1.1.4供試菌株。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金公司。

1.2方法

注：泳道1～3為TE、ES1、ES2 3種方法提取白木香愈傷組織DNA進(jìn)行擴(kuò)增；泳道4～6為TE、ES1、ES2 3種方法提取白木香葉片DNA進(jìn)行擴(kuò)增；泳道7為Marker。

圖2不同方法提取DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2表明，擴(kuò)增愈傷組織TUA基因183 bp長(zhǎng)度的片段，ES1方法和ES2方法均可得到擴(kuò)增產(chǎn)物。而擴(kuò)增葉片DNA中的TUA基因，只有ES1方法可得到擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)克隆和測(cè)序分析，這得到的3條片段均為正確條帶。這個(gè)結(jié)果表明ES1方法可用于提取白木香愈傷組織和葉片的總DNA，該DNA可用于擴(kuò)增較短片段DNA序列。ES2方法可用于提取白木香愈傷組織總DNA并擴(kuò)增較短片段DNA序列。雖然ES2法所得的抽提混合物經(jīng)瓊脂糖電泳并不能檢測(cè)到DNA條帶，但由于ES2法包含一步熱浴的步驟，可能通過該步驟可使部分蛋白變性，雖然混合物中仍含有變性蛋白，但部分核酸亦可釋放出來，只是由于變性蛋白堵塞膠孔導(dǎo)致無法辨析目的DNA條帶。但這種方法提出DNA的效果仍然有限，僅適用于提取愈傷組織DNA和小片段擴(kuò)增。

對(duì)于較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增效果如圖2，采用所有方法得到的愈傷組織和葉片DNA，只有ES1法提取的DNA可擴(kuò)增出593 bp長(zhǎng)的AsS基因片段，其他方法均無法擴(kuò)增出目的條帶。條帶的正確性也經(jīng)過了測(cè)序檢驗(yàn)。表明ES1方法提取的白木香愈傷組織和葉片的總DNA也可用于擴(kuò)增較長(zhǎng)片段DNA序列（600 bp）。PCR結(jié)果也顯示用ES1方法提取的愈傷組織DNA擴(kuò)增效果好于葉片DNA，可能是由于白木香愈傷組織中復(fù)雜的化學(xué)成分較少，擴(kuò)增干擾較小。

圖3表明，熒光定量PCR結(jié)果與普通PCR結(jié)果一致，對(duì)于TUA基因片段的擴(kuò)增，ES1法提取的愈傷與葉片DNA以及ES2方法提取的愈傷DNA可擴(kuò)增出具有相同的溶解峰的產(chǎn)物。對(duì)于AsS基因片段的擴(kuò)增，ES1法得到的2種組織的DNA可以擴(kuò)增出具有相同溶解峰的產(chǎn)物。進(jìn)一步證實(shí)了前面的結(jié)果。同時(shí)也表明，ES1法提取的DNA可用于進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。注：A為ES1法提取的愈傷與葉片DNA擴(kuò)增所得TUA基因片段和ES2法提取的愈傷DNA擴(kuò)增所得TUA基因片段的溶解曲線；B為ES1法提取的愈傷與葉片DNA擴(kuò)增所得AsS基因片段的溶解曲線。

圖3不同方法提取DNA的熒光定量PCR的溶解曲線安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年3結(jié)論與討論

試驗(yàn)通過比較3種植物快速DNA提取方法確定了適用于白木香愈傷組織和葉片的快速DNA提取方法為：取20 mg愈傷組織或葉片，加入ES1提取緩沖液，使用電動(dòng)組織研磨器研磨，離心取上清，異丙醇沉淀DNA，最后用超純水溶解。該方法可于20 min內(nèi)提取12份白木香愈傷和葉片DNA（提取份數(shù)依離心機(jī)轉(zhuǎn)子情況而定），獲得的DNA可用于分子種質(zhì)鑒定等分子研究。試驗(yàn)不但確定了白木香愈傷組織和葉片快速提取DNA的最佳方法，也為沉香屬植物快速提取DNA提供了參考。

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