董榮書 張潔 黃艷霞等

摘 要 采用水培的方法，設(shè)3個(gè)磷水平，7個(gè)菌株，通過對(duì)株高、莖葉鮮重、莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量的測(cè)定及綜合分析，確定使熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌菌株達(dá)到最佳促生性能的磷濃度。結(jié)果表明：7個(gè)菌株在中磷時(shí)鮮重和含氮量最大，低磷不利于鮮重和含氮量的增加；經(jīng)主因子綜合分析，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在高磷時(shí)對(duì)熱研2號(hào)柱花草有最好的固氮促生效果，菌株LZ3-2、BS1-1、PN13-3在中等磷條件下有最好的固氮促生效果，菌株FS3-1-1在高磷和中磷都有最好的固氮促生效果。

關(guān)鍵詞 熱研2號(hào)柱花草；根瘤菌；最佳促生效果

中圖分類號(hào) S54 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

熱研2號(hào)柱花草[Stylosanthes guianensis（Aublet）Swartz cv. Reyan No.2]由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心選育自184柱花草（Stylosanthes guianensis CIAT184），在我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)有較強(qiáng)的適應(yīng)性[1]。熱研2號(hào)柱花草具有莖葉產(chǎn)量高，適口性好，營(yíng)養(yǎng)豐富，刈割后再生能力強(qiáng)，接種根瘤菌后固氮能力強(qiáng)的特性，在我國(guó)南方廣泛用于飼草、綠肥及水保[2-7]。接種高效根瘤菌是柱花草栽培的重要手段[8]，能有效的提高柱花草的產(chǎn)量及含氮量。目前在我國(guó)篩選出適合于熱研2號(hào)柱花草的高效菌株有6個(gè)[9]，相對(duì)于不接種可增產(chǎn)達(dá)4.98倍、含氮量增加可達(dá)2.04倍[10]。豆科植物接種根瘤不僅與植株與菌株基因型的搭配有關(guān)，還受外界環(huán)境的影響[11-12]。磷在豆科作物的生長(zhǎng)和結(jié)瘤固氮過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。缺磷對(duì)豆科作物根瘤形成和生長(zhǎng)的影響大于其對(duì)植物體生長(zhǎng)的影響[15-16]，對(duì)大豆、蠶豆等作物的研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)磷可以促進(jìn)結(jié)瘤和固氮，但過多也會(huì)抑制根瘤的固氮效果[17-18]。在柱花草方面尚無對(duì)柱花草-根瘤菌體系最適磷濃度的研究，本研究通過水培對(duì)接種不同根瘤菌的熱研2號(hào)柱花草進(jìn)行不同濃度的磷處理，確定使熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌菌株達(dá)到最佳促生性能的磷濃度，以期為柱花草高產(chǎn)栽培的科學(xué)用肥及根瘤菌的科學(xué)施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熱研2號(hào)柱花草由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草中心提供；供試菌株[19]及來源見表1；磷源用KH2PO4（AR），不同磷處理間少的K用K2SO4（AR）補(bǔ)足。

1.2 方法

1.2.1 無菌種苗的準(zhǔn)備 柱花草種子剝?nèi)シN皮，在80 ℃的熱水中浸泡5 min；分別于95%的乙醇（V/V，下同）和2 g/L的HgCl2溶液中浸泡5 min和3 min（滅菌）；取出，用無菌水沖洗5～6次；種子撒播在已滅菌鋪有發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿中，發(fā)芽紙上澆無菌的50 μmol/L硫酸鈣溶液；于黑暗中發(fā)芽。待芽長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)移到1.5 mL的切除底部的小離心管中培養(yǎng)，離心管事先分裝好MS培養(yǎng)基，離心管固定在0.2 cm厚的定植板上，最后將定植板放在裝有1/2 Hoaglang營(yíng)養(yǎng)液[8]的面包箱中育苗2周。

1.2.2 根瘤菌菌液的準(zhǔn)備 以YMA（Yeast Mannitol Agar）培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制固體、液體培養(yǎng)基放置2 d確認(rèn)無污染后將保存的各菌株活化于固體培養(yǎng)基上；培養(yǎng)5 d后將菌落接種于液體培養(yǎng)基中，在180 r/h、28 ℃搖床上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600>0.9）。

1.2.3 水培系統(tǒng)的準(zhǔn)備、移苗及處理 水培試驗(yàn)用2 L小桶，小桶先用1 g/L高錳酸鉀浸泡2 min然后用去離子水沖洗晾干，小桶外圍用黑色袋套住遮光。定植板用厚1 cm泡沫板，每塊泡沫板上四邊均勻鉆4個(gè)小洞。水培通氣裝置有通氣泵、通氣管、通氣石、通氣接口、定時(shí)器。

育苗2周后，將離心管帶苗移到小桶定植板上，用海綿固定。移苗后第一周用1/4 Hoaglang營(yíng)養(yǎng)液穩(wěn)定苗生長(zhǎng)；移苗第二周用氮濃度100 mol/L的低氮營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)接菌。將備用的菌液淋在根上，每株柱花草接5 mL菌液，并暫停通氣；3 d后再通氣。2周后每4 h通氣15 min。每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液；每2 d調(diào)一次營(yíng)養(yǎng)液pH值至5.8。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用雙因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。菌株因子設(shè)8個(gè)水平（即設(shè)8個(gè)處理，包括接種R1～R7根瘤菌和不接種對(duì)照R8）；磷濃度因子設(shè)PL（低磷）、PM（中磷）、PH（高磷）3個(gè)水平，磷濃度CP：分別為5、150、200 μmol/L；4次重復(fù)。營(yíng)養(yǎng)液pH值為5.8。

1.2.5 取樣及各指標(biāo)的測(cè)定 3個(gè)月后進(jìn)行收獲。剪下莖葉稱鮮重后放入信封于烘箱105 ℃殺青20 min，75 ℃烘干后稱重。地上部干樣用于氮的測(cè)定。將樣品粉碎，先用H2SO4-H2O2進(jìn)行消煮，用自動(dòng)定氮儀（Kjedahl 2300）測(cè)定全氮。

用乙烯還原法通過氣相色譜測(cè)定根瘤固氮酶活性[8]。固氮酶活性以每小時(shí)每克鮮瘤將乙炔轉(zhuǎn)化為乙烯的能力表示[μmol/（h·g）]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2000、JMP9等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，以Tukey HSD作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，顯著水平p<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌鮮重和含氮量最佳磷濃度的確定

熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌莖葉鮮重在不同磷處理間差異顯著，不同菌株間變化情況也有差異。熱研2號(hào)柱花草接種7株菌株后莖葉鮮重在不同磷處理下的變化情況可分為3類：接種菌株R1、R2、R3后中磷的莖葉鮮重顯著高于高磷和低磷，高磷和低磷間差異不顯著；接種菌株R4后，中磷>高磷>低磷，三者差異顯著；接種菌株R5、R6、R7后，高磷和中磷間差異不顯著，低磷顯著低于二者。

熱研2號(hào)柱花草接種7個(gè)根瘤菌菌株在不同磷處理下莖葉含氮量除接種菌株R1差異不顯著外，其他6個(gè)菌株都呈現(xiàn)中磷顯著高于低磷且高磷與低磷差異不顯著的規(guī)律。

2.2 熱研2號(hào)柱花草接種根瘤菌的最適磷濃度的確定

通過對(duì)不同磷處理下熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌的株高、莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標(biāo)進(jìn)行因子分析，前2個(gè)因子的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到79.58%（一般情況下，累積貢獻(xiàn)率超過75%即可），因此可提煉2個(gè)公因子。通過最大方差旋轉(zhuǎn)法得到旋轉(zhuǎn)因子載荷矩陣。在第一公因子（F1）中，株高、固氮酶活性、莖葉干重、莖葉含氮量等5個(gè)指標(biāo)上具有大的載荷（一般情況下，將載荷絕對(duì)值大于0.4的視為高載荷），F(xiàn)1是除植株含磷量外的性狀的綜合體現(xiàn)，代表了熱研2號(hào)柱花草接種根瘤菌后在不同磷水平下的生物量和固氮能力，F(xiàn)1的方差貢獻(xiàn)率為58.63%；在F2中，植株含磷量具有較高的正載荷，F(xiàn)2可稱為植株含磷因子，該因子的方差貢獻(xiàn)率為20.95%。

根據(jù)各個(gè)觀測(cè)值在第一和第二主因子上的標(biāo)準(zhǔn)得分，繪制關(guān)于生物量和固氮能力（X軸）和植株含磷量（Y軸）的二維平面圖。R1H、R2M、R3H、R3M、R4H、R5M、R6M、R7H位于圖中的第1象限在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是正值，熱研2號(hào)柱花草菌株接種菌株R1、R7的最適磷濃度為高磷，接種菌株R2、R4、R5、R6的最適磷濃度為中磷，接種菌株R3在中磷和高磷都能達(dá)到較好的固氮促生效果；R1L、R2L、R3L、R4L、R5L、R6L、R7L位于圖中的第3象限，在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是負(fù)值，低磷條件不利于各菌株與熱研2號(hào)柱花草的共生固氮作用。

3 討論與結(jié)論

土壤缺磷是限制豆科作物生產(chǎn)的重要因素[20-21]，適量的磷不僅能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，還能促進(jìn)豆科作物結(jié)瘤固氮作用，在豆科植物上有“以磷促氮”的說法[22]。程鳳嫻[23]在試驗(yàn)中證明了磷對(duì)根瘤菌共生固氮起著重要的作用，磷能促進(jìn)根瘤菌的固氮活性。在大豆的研究中當(dāng)磷濃度為9.3～37.0 mg/L時(shí)，大豆的植株生長(zhǎng)量、根瘤數(shù)、根瘤干重、固氮活性和氮積累量會(huì)大幅下降[17]。本研究不同磷處理對(duì)熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌后鮮重和含氮量的影響呈現(xiàn)低磷不利于熱研2號(hào)柱花草鮮重和含氮量的增加，中磷條件對(duì)柱花草鮮重和含氮量的促進(jìn)作用最大，隨磷濃度的增加柱花草的鮮重和含氮量反而降低的規(guī)律，但不同菌株的接種效果存在較大的差異。接種菌株YM11-1、LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2在磷濃度為150 μmol/L時(shí)有最大的鮮重，接種菌株BS1-1、CJ1、PN13-3在150～200 μmol/L都有最大的鮮重，接種菌株LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2、BS1-1、CJ1、PN13-3在150 μmol/L的含氮量最大。齊敏興等[24]在不同磷水平對(duì)接種根瘤菌紫花苜蓿生長(zhǎng)特性影響的研究中也得到類似的結(jié)果，但熱研2號(hào)柱花草最佳磷水平的磷濃度較紫花苜蓿的（1 000 μmol/L）低。

不同根瘤菌對(duì)磷素的需求量及吸收利用力存在很大的差異，豆科植物接種根瘤形成共生系統(tǒng)，磷對(duì)共生系統(tǒng)的影響主要由磷對(duì)根瘤和對(duì)植株的影響構(gòu)成，研究結(jié)果表明：植物結(jié)瘤和保持固氮酶活性比正常生長(zhǎng)需更多的磷[25-26]，但過高的磷會(huì)加大植株的呼吸強(qiáng)度，引起養(yǎng)分消耗，不利于植株的正常發(fā)育[27]。所以，根瘤菌高效固氮的條件篩選必須根據(jù)栽培目的選擇篩選的指標(biāo)，通過綜合分析確定使植株和根瘤都達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)的磷濃度。本研究在通過鮮重和含氮量確定熱研2號(hào)柱花草接種不同根瘤菌的最佳磷濃度的基礎(chǔ)上，加入莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標(biāo)進(jìn)行主因子分析，得出不同菌株與熱研2號(hào)柱花草共生的最適磷濃度，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在磷濃度為200 μmol/L時(shí)對(duì)熱研2號(hào)柱花草有最好的固氮促生效果；菌株LZ3-2、BS1-1、CJ1在磷濃度為150 μmol/L條件下有最好的固氮促生效果；菌株FS3-1-1在磷濃度為150～200 μmol/L都有最好的固氮促生效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 蔣侯明， 何朝族， 李居正， 等. 熱帶優(yōu)良豆科牧草——熱研2號(hào)柱花草的選育及推廣[J]. 熱帶作物研究， 1992（1）： 62-66.

[2] 蔣侯明， 何華玄. 熱研2號(hào)柱花草栽培及利用[J]. 草業(yè)科學(xué)， 1993（1）： 51-52.

[3] 鄭邦興， 沈裕芳. 柱花草在我省大農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技， 1995， 20（3）： 31-32.

[4] 唐燕瓊， 吳紫云， 劉國(guó)道， 等. 柱花草種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2009， 44（6）： 752-762.

[5] 莊道源， 黎學(xué)培， 黎金瓦. 膠園套種山毛豆和柱花草技術(shù)推廣[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 31（10）： 1-3.

[6] 白昌軍， 劉國(guó)道， 何華玄， 等. 海南半干旱地區(qū)芒果間作柱花草及作物效益初探[J]. 草地學(xué)報(bào)， 2003， 11（4）： 350-357.

[7] 蔡小艷， 賴志強(qiáng)， 易顯鳳， 等. 我國(guó)南方柱花草的利用現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2010（3）： 51-53.

[8] 林志強(qiáng). 柱花草栽培技術(shù)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008（7）： 135-137.

[9] 董榮書. 熱研2號(hào)柱花草高效固氮根瘤菌的篩選[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（7）： 1-7.

[10] 董榮書. 柱花草高效固氮根瘤菌株系的篩選[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010： 25-28.

[11] Pirbalouti A G， Allahdadi I， Akbari G A， et al. Effects of different strains of Rhizobium legominosarum biovar phaseoli on yield and N2 fixation rate of common bean（Phaseolus vulgaris L.）Iranian cultivars[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences， 2006， 9（9）： 1 738-1 743.

[12] Aguilar O M， Riva O， Peltzer E. Analysis of Rhizobium etli and of its symbiosis with wild Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host diversification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（37）： 13 548-13 553.

[13] Marschner H. Mineral Nutrition of Higher Plants. 2nd Edition[M]. London， Harcourt Brace & Company， 1995： 899.

[14] Robson A D， Ohara G W， Abbott L K. Involvement of phosphorus in nitrogen fixation by subterranean clover（Trifolium subterraneum L.）[J]. Australian Journal of Plant Physiology， 1981， 8（5）： 427-436.

[15] Ohwaki Y， Sugahara K. Active extrusion of protons and exudation of carboxylic acids in response to iron deficiency by roots of chickpea（Cicer arietinum L.）[J]. Plant and Soil， 1997， 189（1）： 49-55.

[16] Israel D W. Investigation of the role of phosphorus in symbiotic dinitrogen fixation[J]. Plant Physiology， 1987， 84（3）： 835-840.

[17] 丁 洪， 李生秀. 磷素營(yíng)養(yǎng)與大豆生長(zhǎng)和共生固氮的關(guān)系[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1998（5）： 70-73.

[18] 王清湖， 敬 巖， 張 慧， 等. 接種根瘤菌和施磷肥對(duì)蠶豆共生固氮及產(chǎn)量的影響[J]. 甘肅科學(xué)學(xué)報(bào)， 1996（4）： 16-19.

[19] 董榮書， 黃艷霞， 劉國(guó)道， 等. 柱花草根際土著根瘤菌的豐度及其遺傳多樣性[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（6）： 908-913.

[20] Yan X L， Beebe S E， Lynch J P. Phosphorus efficiency in common bean genotypes in contrasting soil types. Ⅱ. Yields response[J]. Crop Science， 1995， 35： 1 094-1 099.

[21] 廖 紅， 嚴(yán)小龍. 華南酸性紅壤中菜豆種質(zhì)耐低磷特性的評(píng)價(jià)[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1998， 19（2）： 20-25.

[22] 晁明亮. 以磷增氮[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1963（1）： 62-63.

[23] 程鳳嫻， 曹桂芹， 王秀榮， 等. 華南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用[J]. 科學(xué)通報(bào)， 2008（23）： 2 903-2 910.

[24] 齊敏興， 劉曉靜， 張曉磊， 等. 不同磷水平對(duì)接種根瘤菌紫花苜蓿生長(zhǎng)特性的影響[J]. 草原與草坪， 2013（1）： 50-53.

[25] 劉麗君， 孫聰姝. 氮肥對(duì)大豆結(jié)瘤及葉片氮素積累的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 36（2）： 133-137.

[26] Li X L， Cao Y P. Study on m ethod for investigating nutrient changes in the hypae-so il inte rface[J]. Beijing Ag ric Univ， 1992， 18（1）： 59-63.

[27] 東北師范大學(xué)生物系. 大豆生理[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1981： 204-206.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)