王登科，于翔宇，張學(xué)風(fēng)，黃蕾，李曉婷，賀治斌，康林，王黨軍，姚露花，郭彥軍

(西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716)

豆科綠肥作物是一種養(yǎng)分全面的優(yōu)質(zhì)生物肥源，也是我國(guó)農(nóng)作物種植制度中重要的輪作倒茬作物，在提供作物養(yǎng)分、改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境和防止土壤侵蝕及污染等方面起到積極的作用[1]。如，作物休閑期種植綠肥有利于改善土壤質(zhì)量、提高后茬作物產(chǎn)量[2-3]；種植綠肥后，后茬玉米(Zeamays)氮素利用效率有所提高[4]，并可降低后茬小麥(Triticumaestivum)氮肥施用量[5]。然而，對(duì)于豆科綠肥作物而言，全球氣候變化及人類不合理的土地利用方式所引起的土壤質(zhì)量退化，包括鹽堿化、酸化等[6]，嚴(yán)重限制了豆科作物的生長(zhǎng)及其根瘤的生物固氮能力，影響其在生產(chǎn)中的推廣種植[7-8]。

鹽堿脅迫可引起植物生理干旱，使植物根系及種子發(fā)芽時(shí)不能從土壤中吸收足夠的水分[9]；減少植物對(duì)鉀、磷和其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[10]；影響植物的氣孔關(guān)閉，植物容易干旱枯萎[11]。隨著土壤pH值的降低，礦物結(jié)構(gòu)和有機(jī)絡(luò)合態(tài)錳、鋁等易被活化，活性鋁的溶出量增加[12]，抑制植物根系生長(zhǎng)[13]，影響營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[14]。豆科與根瘤菌形成的共生系統(tǒng)對(duì)逆境脅迫尤為敏感。根瘤菌適宜的pH值為6.5～7.5[15]，過(guò)低的土壤pH值影響根瘤菌存活，抑制宿主與根瘤菌的親和力，降低生物固氮能力[16]。如鋁脅迫下，根瘤菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分裂、酶系統(tǒng)等受到毒害影響，對(duì)結(jié)瘤和固氮產(chǎn)生抑制作用[17-18]。在鹽脅迫下，高滲透環(huán)境抑制細(xì)胞分裂、降低根瘤菌密度及細(xì)胞高精脒含量，使固氮能力顯著下降[19-20]。在逆境脅迫下，根瘤菌自身會(huì)形成一些抗性機(jī)制，如細(xì)胞外排、胞外沉淀、主動(dòng)輸出、酶類解毒及降低細(xì)胞對(duì)鋁、酸和鹽敏感性等[21-22]。隨著pH水平的下降，天藍(lán)苜蓿(Medicagolupulina)根瘤菌抗氧化酶活性顯著高于紫花苜蓿(Medicagosativa)根瘤菌，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸、耐鋁性[23]。說(shuō)明豆科植物根瘤菌對(duì)酸、鋁、鹽等脅迫存在明顯的基因型差異[24-25]，可針對(duì)不同的土壤環(huán)境選擇適宜的豆科作物進(jìn)行種植。

竹豆(Phaseoluscalcaratns)、田菁(Sesbaniacannabina)、綠豆(Vignaradiata)、豇豆(Vignaunguiculata)等為夏季主要的豆科填閑植物。有關(guān)這些植物逆境脅迫方面的研究多集中在植物養(yǎng)分吸收上[26]，鮮有研究比較它們根瘤菌的抗氧化酶活性差異。鑒于此，本研究通過(guò)設(shè)置不同水平pH、活性鋁含量和氯化鈉含量，研究了不同根瘤菌的抗氧化酶活性，包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過(guò)氧化物酶)、CAT(過(guò)氧化氫酶)及GR(谷胱甘肽還原酶)。同時(shí)，考慮到早期種子萌發(fā)階段對(duì)逆境脅迫較為敏感，分析了上述逆境脅迫下豆科綠肥作物種子的萌發(fā)特性。旨在通過(guò)選擇適宜的豆科綠肥作物品種，為改良和利用鹽漬地和酸性土壤提供理論依據(jù)與實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗(yàn)選擇的豆科綠肥作物品種有4個(gè)，包括竹豆、綠豆、普通田菁和豇豆。其中竹豆2015年購(gòu)自江西進(jìn)賢芽苗菜公司；田菁為普通田菁，2015年購(gòu)自鄭州世紀(jì)天緣公司；綠豆為冀綠7號(hào)，豇豆為重慶二巴豇，均為2015年購(gòu)自重慶市北碚區(qū)種子公司。

1.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)于2017年6-7月在西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院飼料作物研究所進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)NaCl脅迫水平，即0、40、120和200 mmol·L-1；4個(gè)活性鋁(Al3+)水平，即0、50、100和200 mg·L-1，利用Al2SO4·18H2O配制；4個(gè)pH水平，即4、5、6和7。選取大小均勻、無(wú)蟲(chóng)眼的竹豆、綠豆、田菁和豇豆種子，消毒后(3%H2O2溶液消毒3 min)，用清水清洗3次，然后采用紙上發(fā)芽法，按每個(gè)培養(yǎng)皿30粒種子分別放在加入5 mL各個(gè)處理溶液的濾紙(直徑12 cm的培養(yǎng)皿雙層濾紙)床中進(jìn)行發(fā)芽，清水做對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。在(24±2) ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽，光照變幅12 h/12 h。每日用約5 mL處理液淋洗種子，防止種子發(fā)霉，并保持培養(yǎng)皿有一定的處理溶液。從每個(gè)品種開(kāi)始發(fā)芽的第1天，每隔24 h觀察并記錄種子的發(fā)芽數(shù)，直至無(wú)萌發(fā)種子出現(xiàn)為止[27]，共記錄7次。

1.3 供試根瘤菌菌株的分離、純化

于2015年8月在重慶市合川區(qū)西南大學(xué)試驗(yàn)田采集竹豆、綠豆、田菁和豇豆4種綠肥作物的根瘤，分離純化竹豆根瘤菌、綠豆根瘤菌、田菁根瘤菌和豇豆根瘤菌。西南大學(xué)合川試驗(yàn)基地，年平均氣溫18.4 ℃，年日照時(shí)數(shù)1342.6 h，年降水量1552.7 mm，年相對(duì)濕度84%，平均風(fēng)速0.7 m·s-1，土壤呈弱酸性(pH值6.5)。

1.3.1菌株純化 分別對(duì)采集的根瘤經(jīng)95%的酒精殺菌處理10 s后，再用3% H2O2消毒3～5 min，用無(wú)菌水沖洗3～5次后，加1滴無(wú)菌水，把根瘤菌搗碎，用接種環(huán)挑取一環(huán)根瘤的汁液接種到醇母甘露醇培養(yǎng)基(YMA)上，劃線分離，在28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成，選取單菌落，劃線分離培養(yǎng)，連續(xù)2次，得到純的根瘤菌菌株。

純化培養(yǎng)采用YMA固體培養(yǎng)基(甘露醇10 g·L-1，酵母提取物1 g·L-1，蒸餾水800 mL·L-1，土壤提取液200 mL·L-1，瓊脂30 g·L-1)。

1.3.2擴(kuò)大培養(yǎng) 將純化后的菌種用5 mL無(wú)菌水洗脫于裝有液體培養(yǎng)基(YMB)的錐形瓶(150 mL)中，至于搖床(150 r·min-1)恒溫(28 ℃)培養(yǎng)至指數(shù)期，備用。

YMB液體培養(yǎng)基：甘露醇10 g·L-1、酵母提取物1 g·L-1、蒸餾水800 mL·L-1和土壤提取液200 mL·L-1，用 0.1 mol·L-1NaOH或HCl調(diào)pH值至6.8。

1.4 根瘤菌脅迫處理

于2017年1月開(kāi)展根瘤菌脅迫處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)NaCl脅迫水平，即0、10、20、30和40 g·L-1；5個(gè)活性鋁(Al3+)水平，即0、25、50、75和100 μmol·L-1；4個(gè)pH水平，即4、5、6和7。通過(guò)在培養(yǎng)基(YMB)中加入分析純NaCl試劑調(diào)節(jié)NaCl水平；加入分析純AlCl3調(diào)節(jié)活性鋁含量。通過(guò)在培養(yǎng)基(YMB)加入HCl調(diào)節(jié)pH水平。

各綠肥作物根瘤菌菌種于超凈工作臺(tái)接種至裝有處理溶液的液體培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r·min-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)。24 h后每日測(cè)定溶液OD值(600 nm，吸光值)，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止培養(yǎng)，置于4 ℃冰箱備用。以不接種為對(duì)照，各處理重復(fù)3次。

1.5 根瘤菌抗氧化酶活性測(cè)定

1.5.1細(xì)胞破碎和粗酶液提取 各處理菌液于4 ℃、8000 r·min-1離心5 min，收集菌體。將收集的菌體用磷酸緩沖液(0.05 mmol·L-1, pH 7.8，4 ℃預(yù)冷)混勻洗滌3次，置于無(wú)菌濾紙上，洗去表面余液。然后置于10 mL離心管中，記錄菌體質(zhì)量，加4 mL磷酸鹽提取液[0.05 mmol·L-1, pH 7.8，含1% 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP),4 ℃]混勻，置于冰上超聲波破壁，離心15 min(4 ℃，1500 r·min-1)，上清液為抗氧化酶粗提液，保存于-20 ℃冰箱以備用。

1.5.2抗氧化性酶活性測(cè)定 超氧化物歧化酶(superoxide dsmutase，SOD)活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)光化還原法[28]，將NBT光化還原反應(yīng)抑制到50%為一個(gè)酶活性單位(U)。過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定[29]，以每分鐘減少0.1個(gè)OD值所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[30]，在H2O2存在下POD催化愈創(chuàng)木酚生成棕色聚合物，在470 nm有特征吸收峰，以每分鐘內(nèi)A470變化為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位(U)。谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)的活性采用還原型輔酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide,NADPH)法[31-32]，以每分鐘每毫克蛋白氧化1 nmol NADPH為一個(gè)活性單位(U)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用二因素方差分析法分析品種與不同處理(酸、活性鋁、鹽脅迫)對(duì)種子萌發(fā)、根瘤菌抗氧化酶(SOD、CAT、POD、GR)活性的影響，顯著水平為P<0.05(l.s.d)。數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸、鋁、鹽脅迫及品種影響發(fā)芽率及根瘤菌抗氧化酶活性的方差分析

酸、鋁、鹽脅迫顯著影響幾種豆科綠肥作物的種子發(fā)芽率及其根瘤菌的抗氧化酶活性，其中根瘤菌抗氧化酶活性較綠肥種子發(fā)芽率對(duì)脅迫更敏感(表1)。整體上，隨活性鋁濃度和NaCl濃度的增加及pH水平的下降，綠肥作物根瘤菌各抗氧化酶活性呈下降趨勢(shì)。在脅迫條件下，不同綠肥作物的發(fā)芽率及其根瘤菌抗氧化酶活性也存在顯著品種差異，且整體表現(xiàn)出品種與脅迫的交互作用。

表1 酸、鋁、鹽脅迫及品種影響豆科綠肥作物發(fā)芽率及根瘤菌抗氧化酶活性的方差分析(F值)Table 1 Analysis of the effects of acid, aluminum, salt stress and cultivars on the germination rate and the activities of the rhizobia antioxidant enzymes in legume green manures (F value)

*，P<0.05; **,P<0.01; ***,P<0.001.

2.2 竹豆、綠豆、田菁和豇豆種子發(fā)芽率

豆科綠肥作物種子發(fā)芽率對(duì)環(huán)境pH水平、活性鋁濃度及鹽濃度的敏感性不同，且存在顯著的品種差異(表2)。在4個(gè)pH水平下，田菁種子在pH值為4時(shí)不發(fā)芽，pH值為5時(shí)發(fā)芽率只有36.67%，而pH值為6和pH值為7時(shí)保持在60%左右；其余品種發(fā)芽率對(duì)4個(gè)pH水平無(wú)顯著響應(yīng)。在4個(gè)不同活性鋁濃度下，所有品種均表現(xiàn)為發(fā)芽率隨濃度增加而顯著下降的趨勢(shì)，且Al3+含量為0 mg·L-1時(shí)發(fā)芽率最高，至100 mg·L-1時(shí)發(fā)芽率分別下降82%(綠豆)、76%(竹豆)、65%(田菁)和54%(豇豆)，至200 mg·L-1時(shí)，所有品種均無(wú)發(fā)芽。各品種發(fā)芽率對(duì)鹽濃度的反應(yīng)不一致，其中竹豆和綠豆在NaCl 達(dá)到40 mmol·L-1時(shí)最高，顯著高于120和200 mmol·L-1時(shí)；田菁在120 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于其他鹽濃度時(shí)的發(fā)芽率；而豇豆在各鹽濃度下均無(wú)顯著差異。

2.3 酸脅迫對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響

豆科綠肥作物根瘤菌的生長(zhǎng)及抗氧化酶活性對(duì)環(huán)境pH水平的變化較為敏感(表3)。隨著pH水平的提高，各根瘤菌菌液的OD值呈增加趨勢(shì)。竹豆和豇豆根瘤菌pH值為6和pH值為7時(shí)的OD顯著高于pH值為4和pH值為5時(shí)；田菁根瘤菌pH值為7時(shí)的OD值顯著高于pH值為5和pH值為6時(shí)，而pH值為4時(shí)的OD值最低；綠豆根瘤菌OD值處理間差異不顯著。不同品種根瘤菌間比較，pH值為4時(shí)的OD值，豇豆根瘤菌為1.67，顯著高于竹豆根瘤菌(1.35)；而綠豆根瘤菌和田菁根瘤菌均低于1.2。

各根瘤菌抗氧化酶活性，整體隨pH水平的增加呈增加趨勢(shì)，且pH值為7時(shí)的SOD、CAT、POD及GR酶活性顯著高于pH值為4時(shí)的(表3)。根瘤菌SOD酶活性對(duì)pH最敏感的是田菁根瘤菌，其pH值為5、6和7時(shí)的SOD酶活性較pH值為4時(shí)分別增加122%、266%和625%；竹豆和綠豆根瘤菌SOD酶活性較pH值為4時(shí)提高32%～116%；而豇豆根瘤菌SOD酶活性較pH值為4提高不足50%。CAT酶活性對(duì)pH最敏感的是綠豆根瘤菌，其pH值為5、6和7時(shí)的CAT酶活性較pH值為4時(shí)分別增加96%、216%和315%；竹豆、田菁和豇豆根瘤菌pH值為7時(shí)的CAT酶活性較pH值為4分別提高185%、224%和167%。POD酶活性對(duì)pH最敏感的是竹豆根瘤菌， 其pH值為5、6和7時(shí)的POD酶活性較對(duì)照分別增加113%、229%和248%；綠豆、田菁和豇豆根瘤菌pH值為7時(shí)的POD酶活性較pH值為4分別提高114%、83%和153%。GR酶活性對(duì)pH最敏感的是豇豆根瘤菌，其pH值為5、6和7時(shí)的GR酶活性較pH值為4時(shí)分別增加185%、270%和390%；竹豆、綠豆和田菁根瘤菌pH值為7時(shí)的GR酶活性較pH值為4分別提高225%、181%和193%。

表2 鹽、鋁和酸脅迫對(duì)竹豆、綠豆、田菁和豇豆種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of salt, aluminum and acid stresses on seed germination of P. calcaratns, V.radiata, S. cannabina and V. unguiculata

注：同品種不同處理數(shù)值后小寫(xiě)字母不同表示顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lower case letters after the value for same cultivar represented significance difference atP<0.05 (l.s.d). The same below.

表3 酸脅迫對(duì)竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of acid stress on the growth and antioxidant enzymes activities of rhizobia of P. calcaratns, V. radiata, S. cannabina and V. unguiculata

2.4 鋁脅迫對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響

鋁脅迫顯著影響豆科綠肥作物根瘤菌的生長(zhǎng)及抗氧化酶活性(表4)。整體上，隨著活性鋁濃度的增加，各根瘤菌菌液OD值呈下降趨勢(shì)?；钚凿X濃度低于50 μmol·L-1時(shí)，各豆科根瘤菌OD值較對(duì)照無(wú)顯著變化；當(dāng)活性鋁濃度增加至75和100 μmol·L-1時(shí)，OD值較對(duì)照顯著下降。品種根瘤菌間比較，100 μmol·L-1時(shí)的OD值，豇豆根瘤菌為1.65，顯著高于竹豆根瘤菌(1.26)；而綠豆和田菁根瘤菌分別為1.08和0.84。

表4 鋁脅迫對(duì)竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響Table 4 Effects of aluminum stress on the growth and antioxidant enzymes activities of rhizobia of P. calcaratns, V. radiata, S. cannabina and V. unguiculata

各根瘤菌抗氧化酶活性隨活性鋁濃度的增加呈下降趨勢(shì)。根瘤菌SOD酶活性對(duì)活性鋁最敏感的是田菁根瘤菌，其0、25、50和75 μmol·L-1時(shí)的SOD酶活性較100 μmol·L-1分別增加779%、621%、260%和72%；竹豆和綠豆根瘤菌SOD酶活性較100 μmol·L-1增加40%～175%；而豇豆根瘤菌SOD酶活性較100 μmol·L-1升幅不足60%。CAT酶活性對(duì)活性鋁最敏感的是綠豆根瘤菌，其0、25、50和75 μmol·L-1Al3+時(shí)的CAT酶活性較100 μmol·L-1時(shí)分別增加412%、307%、159%和49%；竹豆、田菁和豇豆根瘤菌0 μmol·L-1時(shí)的CAT酶活性較100 μmol·L-1分別提高258%、289%和302%。POD酶活性對(duì)活性鋁最敏感的是竹豆根瘤菌，其0、25、50和75 μmol·L-1時(shí)的POD酶活性較對(duì)照分別增加265%、249%、180%和127%；綠豆、田菁和豇豆根瘤菌0 μmol·L-1時(shí)的POD酶活性較100 μmol·L-1分別提高128%、75%和167%。各菌液GR酶活性100 μmol·L-1時(shí)較0 μmol·L-1下降422%～555%，品種根瘤菌間GR酶活性差異較其他酶活性小。

2.5 鹽脅迫對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響

隨著NaCl濃度的增加，各根瘤菌菌液OD值呈下降趨勢(shì)，且存在品種差異(表5)。當(dāng)NaCl濃度由0 g·L-1增加至10 g·L-1時(shí)，綠豆根瘤菌OD值顯著下降，而其他品種無(wú)顯著變化；當(dāng)濃度繼續(xù)增加至20 g·L-1時(shí)，除竹豆根瘤菌外，其余根瘤菌OD均顯著下降；當(dāng)濃度達(dá)到40 g·L-1時(shí)，竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌OD值較對(duì)照顯著下降分別為11%、14%、12%和9%。

各根瘤菌抗氧化酶活性隨NaCl濃度的增加也整體呈下降趨勢(shì)(表5)。當(dāng)NaCl濃度由0 g·L-1增加至20 g·L-1時(shí)，竹豆和綠豆根瘤菌SOD酶活性無(wú)顯著變化；田菁和豇豆根瘤菌SOD酶活性顯著下降；當(dāng)濃度達(dá)到40 g·L-1時(shí)，竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌SOD酶活性較對(duì)照顯著下降53%、38%、45%和33%。田菁和綠豆根瘤菌CAT酶活性對(duì)較低濃度NaCl(20 g·L-1)無(wú)顯著響應(yīng)，而竹豆和綠豆根瘤菌顯著下降；當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到40 g·L-1時(shí)，竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌CAT酶活性較對(duì)照下降45%左右。竹豆和綠豆根瘤菌POD酶活性對(duì)低濃度NaCl(20 g·L-1)無(wú)顯著響應(yīng)，而田菁和豇豆根瘤菌顯著下降；當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到40 g·L-1時(shí)，竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌POD酶活性較對(duì)照下降62%、36%、52%和58%。綠豆和田菁根瘤菌GR酶活性對(duì)較低濃度NaCl(20 g·L-1)無(wú)顯著響應(yīng)，而竹豆和豇豆根瘤菌較對(duì)照顯著下降；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到40 g·L-1時(shí)，竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌GR活性較對(duì)照分別顯著下降84%、73%、67%和87%。

表5 鹽脅迫對(duì)竹豆、綠豆、田菁和豇豆根瘤菌生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響Table 5 Effects of salt stress on the growth and antioxidant enzymes activities of rhizobia of P. calcaratns, V. radiata, S. cannabina and V. unguiculata

3 討論

在逆境土壤，種子的成功萌發(fā)與根瘤的形成是確保豆科作物正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵[33]。本試驗(yàn)中，土壤鹽堿化、酸化和活性鋁含量增加均顯著抑制豆科作物種子萌發(fā)及根瘤菌抗氧化酶活性，說(shuō)明這些土壤環(huán)境不利于豆科作物種子的萌發(fā)和共生固氮體系的建立，制約著豆科作物在生產(chǎn)中的推廣種植。然而，豆科作物品種對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)存在品種差異[34]。如田菁種子發(fā)芽率對(duì)pH較敏感，pH值為4時(shí)不發(fā)芽，pH值為5時(shí)發(fā)芽率只有36.67%，顯著低于弱酸性至中性環(huán)境；而竹豆、綠豆和豇豆種子對(duì)pH變化無(wú)顯著響應(yīng)。因此，在酸性土壤選擇豆科綠肥作物時(shí)可不考慮田菁?；钚凿X含量增加是酸性土壤引起植物生長(zhǎng)不良主要原因之一[35]。本試驗(yàn)中，當(dāng)活性鋁濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，所有品種發(fā)芽率降幅均超過(guò)50%，其中綠豆降幅高達(dá)82%，表現(xiàn)最為敏感；至200 mg·L-1時(shí)，所有品種均無(wú)發(fā)芽。因此，在活性鋁含量較高的酸性土壤，種植豆科作物之前需要通過(guò)調(diào)節(jié)土壤酸堿性[36]，降低活性鋁含量[37]，以提高豆科作物的種子萌發(fā)。如施用石灰被廣泛用于改良酸性土壤，提高作物生產(chǎn)[38]。幾種豆科綠肥作物的發(fā)芽率對(duì)鹽濃度的反應(yīng)不一致，且一定的NaCl濃度有利于種子萌發(fā)。如竹豆和綠豆的發(fā)芽率在NaCl 達(dá)到40 mmol·L-1時(shí)最高，田菁在120 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，而豇豆在不同NaCl濃度下無(wú)顯著差異。品種間存在的耐鹽性差異可能與不同作物對(duì)鹽分離子的吸收和累計(jì)具有不同的特點(diǎn)有關(guān)[39]，其中豇豆和田菁萌發(fā)期可能通過(guò)吸收較多鈉離子提高細(xì)胞束縛水的能力，以抵御鹽害。

相對(duì)于種子萌發(fā)，豆科綠肥作物根瘤菌對(duì)酸、活性鋁及鹽的敏感性較高。整體上，隨著pH水平的下降、活性鋁濃度增加和鹽濃度的增加，根瘤菌的生長(zhǎng)及抗氧化酶活性均受到不同程度的抑制。一方面，不利的土壤環(huán)境條件可通過(guò)影響根瘤菌的繁殖，降低其與宿主植物之間的親和性[40]。另一方面，根瘤菌抗氧化酶參與其對(duì)逆境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)過(guò)程[41]，以保證其在逆境中的存活。如SOD能消除根瘤菌在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[42]，POD(CAT)能水解去除H2O2、氫化有毒化合物等[43]，而GR能保護(hù)細(xì)胞免受氧化劑和抗生素的影響[44]。這些酶活性在逆境中的下降可能也是導(dǎo)致根瘤菌生長(zhǎng)受阻的直接原因。在Cu2+濃度≤0.8 mmol·L-1脅迫下，苜蓿中華根瘤菌抗性菌株可通過(guò)提高SOD、CAT、GPX、GR的活性以降低Cu2+的毒害效應(yīng)[21]。

本試驗(yàn)中，酸脅迫下竹豆、豇豆和田菁根瘤菌OD值顯著降低，而綠豆根瘤菌變化較??；當(dāng)NaCl濃度增加至20 g·L-1時(shí)，竹豆根瘤菌OD無(wú)顯著變化，而其余根瘤菌OD均顯著下降。說(shuō)明不同豆科綠肥作物根瘤菌對(duì)不同逆境脅迫的響應(yīng)存在明顯的品種差異，如綠豆根瘤菌相對(duì)耐酸，而竹豆根瘤菌相對(duì)耐鹽。這種差異可能與不同品種根瘤菌抗氧化酶的調(diào)節(jié)能力不同有關(guān)[41]。如根瘤菌SOD酶活性對(duì)pH和活性鋁最敏感的是田菁根瘤菌，CAT酶活性對(duì)pH和活性鋁最敏感的是綠豆根瘤菌，POD酶活性對(duì)pH和活性鋁最敏感的是竹豆。在苜蓿根瘤菌的研究中，李智燕等[23]發(fā)現(xiàn)天藍(lán)苜蓿根瘤菌的CAT、POD和GR酶活性隨活性鋁濃度增大顯著下降，而紫花苜蓿根瘤菌的SOD、CAT及GR酶活在低鋁脅迫下無(wú)顯著變化，在高鋁脅迫下顯著下降。這些結(jié)果說(shuō)明，不同根瘤菌中參與抵御逆境的抗氧化酶存在差異。品種間根瘤菌抗氧化酶活性調(diào)節(jié)能力的差異可能與各自遺傳背景有關(guān)，而且這種對(duì)能力是相對(duì)穩(wěn)定的[45]。

綜合分析認(rèn)為，不同夏季豆科綠肥品種中，田菁不耐酸、鋁脅迫，但對(duì)鹽脅迫有一定耐受性；竹豆、綠豆和豇豆對(duì)低濃度的鹽和弱酸性環(huán)境有一定耐受性；但是所有品種對(duì)活性鋁濃度增加較為敏感。在酸性和鹽堿化土壤，較高濃度的H+、活性鋁或NaCl抑制種子萌發(fā)，減緩根瘤菌的生長(zhǎng)，降低根瘤菌對(duì)有害物質(zhì)的抗氧化能力，最終限制豆科綠肥作物的早期生長(zhǎng)。整體而言，根瘤菌抗氧化酶活性較發(fā)芽率對(duì)脅迫敏感。