李金超 馬三梅 王永飛 孫小武

摘 要： 綜述了西瓜轉(zhuǎn)基因常用的方法、目前已獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜性狀以及轉(zhuǎn)基因西瓜安全性等方面的研究進展，并提出了今后進一步的研究方向。西瓜轉(zhuǎn)基因常用方法為葉盤轉(zhuǎn)化法；將外源基因?qū)氲轿鞴匣蚪M中常用的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管介導(dǎo)法；常采用PCR、Southern和Western等方法來檢測和鑒定外源基因是否成功整合到西瓜基因組中；目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良的西瓜性狀主要集中在培育抗病毒、抗枯萎病和耐旱、耐鹽堿等方面；對轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性研究主要包括生態(tài)安全性和食品安全性2個方面。今后應(yīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進一步提高西瓜營養(yǎng)品質(zhì)、耐貯性和抗凍性等性狀，并進一步加強對轉(zhuǎn)基因西瓜安全性的研究。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 轉(zhuǎn)基因； 安全性

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Mansfeld]是一種深受人們喜愛的經(jīng)濟水果，屬于葫蘆科植物。西瓜不但汁多味甜、清涼解暑，而且含有豐富的營養(yǎng)成分[1]，在夏季，世界各地對西瓜都有極大的消費量。然而，西瓜的遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源有限，難以通過傳統(tǒng)的育種手段來培育出優(yōu)良性狀的品種[2]。近年來，西瓜的病毒病、土壤病菌感染病等日益嚴(yán)重，給世界各地的瓜農(nóng)帶來巨大的損失[3]。另外，西瓜的抗旱能力弱也是西瓜向干旱地區(qū)推廣種植的一個重要的瓶頸。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為農(nóng)作物改良的有效手段，已被成功地應(yīng)用到西瓜的品種改良上。世界各國的育種者用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出許多品質(zhì)優(yōu)良的西瓜品系，豐富了西瓜的種質(zhì)資源，提高了西瓜對眾多病害的抗性。同時，轉(zhuǎn)基因西瓜對種植地的環(huán)境安全性和作為食品的安全性也得到重視。本文對國內(nèi)外西瓜育種者通常使用的西瓜轉(zhuǎn)基因方法、已獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜，以及轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性3方面進行了綜合歸納，旨在為西瓜的轉(zhuǎn)基因研究提供一些參考。

1 西瓜轉(zhuǎn)基因的方法

隨著各種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的層出不窮，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟。在培育轉(zhuǎn)基因西瓜方面，國內(nèi)外育種者使用的轉(zhuǎn)基因方法及技術(shù)基本上是相似的，其中最常用的是葉盤法[4]。圖1總結(jié)了轉(zhuǎn)基因西瓜培育的基本流程。

圖1 轉(zhuǎn)基因西瓜的基本培育流程

1.1 外源基因?qū)胛鞴匣蚪M的方法

將外源基因重組到西瓜基因組中最常用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法。在轉(zhuǎn)染前，通常先通過植物組織培養(yǎng)得到西瓜子葉的愈傷組織，隨后將子葉愈傷組織與帶有目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時間完成轉(zhuǎn)染，子葉愈傷組織再經(jīng)組織培養(yǎng)即可得到轉(zhuǎn)基因的西瓜苗[5-7]。另一種方法是花粉管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，即外源基因通過花粉管通道進入西瓜雌花的卵巢中而完成轉(zhuǎn)基因。Chen等[8]用此法培育出了對枯萎病有抗性的轉(zhuǎn)基因西瓜。

1.2 外源基因?qū)氲蔫b定

外源基因是否成功整合到西瓜基因組中，常采用PCR、Southern-blot和western-blot等方法來檢測和鑒定[9-11]。PCR可擴增外源DNA以及質(zhì)粒中的其他報告基因，擴增產(chǎn)物再經(jīng)電泳或Southern雜交鑒定。Southern-blot是指用與外源基因同源配對的基因探針對西瓜基因組中的外源基因進行檢測，從DNA水平檢測轉(zhuǎn)基因是否成功。Western-blot用于檢測轉(zhuǎn)基因西瓜表達產(chǎn)生的外源蛋白，從蛋白質(zhì)水平驗證外源基因的成功導(dǎo)入并且表達出相應(yīng)產(chǎn)物。

外源基因及其表達產(chǎn)物被檢測后，還需要進一步考察轉(zhuǎn)基因植株是否產(chǎn)生了期望的性狀。例如，應(yīng)奇才等[12]將西瓜花葉病毒采用磨擦接種法接種到轉(zhuǎn)有該病毒外殼基因的西瓜植株的嫩葉上，通過比較轉(zhuǎn)基因植株和陰性對照植株對該病毒的易感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因西瓜能有效地抵御西瓜花葉病毒的感染。這表明轉(zhuǎn)基因西瓜植株表現(xiàn)出了抗病毒的新性狀。

1.3 外源基因的遺傳穩(wěn)定性

外源基因被成功導(dǎo)入西瓜基因組后，外源基因能否正常地復(fù)制表達并遺傳給下一代，是決定轉(zhuǎn)基因成功與否的一個關(guān)鍵因素。外源基因在傳代過程中可能會發(fā)生分離、丟失等，不能穩(wěn)定的遺傳[13-14]。一般來說，轉(zhuǎn)基因西瓜要進行自交，外源基因純合后，并且能表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀，才能說明轉(zhuǎn)基因的成功。王慧中等[11]培育了轉(zhuǎn)WMV-2病毒外殼蛋白基因的西瓜植株，發(fā)現(xiàn)WMV-2病毒外殼蛋白基因在自交子一代的分離符合孟德爾3∶1 的分離比。經(jīng)過連續(xù)4代的選擇和鑒定，他們最終篩選得到純合的遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因西瓜株系。

2 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜

目前，國內(nèi)外學(xué)者培育轉(zhuǎn)基因西瓜新品種的熱點主要集中在培育高抗逆性西瓜品種上，尤其是抗病毒、抗枯萎病和耐旱、耐鹽堿等方面。

2.1 抗病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜

病毒病是西瓜3大主要病害之一，很容易造成西瓜大面積的減產(chǎn)。對西瓜種植危害最大的病毒主要有3種，分別為西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）[15]。目前，育種者主要通過以下2種方法獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜：一是向西瓜基因組中導(dǎo)入病毒外殼基因。病毒外殼基因表達出病毒的外殼蛋白，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這些病毒外殼蛋白在西瓜中的積累可以抑制病毒侵染西瓜時的脫外殼過程[16-17]。如將西瓜花葉病毒（WMV-2）的外殼蛋白基因?qū)胛鞴匣蚪M，可獲得對WMV-2有較好抗性的轉(zhuǎn)基因西瓜[11]；將黃瓜綠斑駁花葉病毒外殼基因（CGMMV-CP）導(dǎo)入西瓜基因組，獲得的西瓜可有效對抗CGMMV的感染[18]。Curuk等[19]培育的轉(zhuǎn)ZYMV外殼蛋白基因的西瓜可以抵抗ZYMV的侵染，并且能保持西瓜原來優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。美國 Asgrow 種子公司將WMV、CMV 和ZYMV 這3種病毒的外殼基因一起轉(zhuǎn)入與西瓜同為葫蘆科植物的西葫蘆植株的基因組中，獲得了高抗病毒病的轉(zhuǎn)基因西葫蘆品種，并已獲準(zhǔn)上市[20-21]。二是向西瓜基因組中導(dǎo)入病毒的復(fù)制酶基因。如我國學(xué)者牛勝鳥等[15]構(gòu)建了由ZYMV復(fù)制酶基因、CMV復(fù)制酶基因和WMV外殼蛋白基因組成的三價植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到西瓜植株中，得到的轉(zhuǎn)基因西瓜的抗病能力普遍達到中等水平以上，并保持了受體西瓜品系原有的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。

2.2 抗土壤病菌的轉(zhuǎn)基因西瓜

由土壤病菌造成的西瓜病害種類多、危害大。如由尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的西瓜枯萎病是西瓜生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的病害之一， 在世界各西瓜產(chǎn)區(qū)均造成重大損失。由于這些病菌在土壤中可長期存在，傳統(tǒng)的防治手段如打農(nóng)藥、輪作等都難以有好的防治效果[22]。西瓜育種者們一直致力于運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高西瓜對土壤病菌的抵抗能力。國內(nèi)學(xué)者張志忠等[23]培育出了轉(zhuǎn)有番茄幾丁質(zhì)酶基因（Chi3）的西瓜植株，這種具有合成幾丁質(zhì)酶能力的西瓜植株可以降解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)， 從而破壞細(xì)胞壁致使病原體死亡[24-25]。張志忠等[22]培育了同時含有番茄幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的雙價抗真菌西瓜植株[22]。β-1，3-葡聚糖酶可將真菌表層的多糖水解，暴露出內(nèi)層的幾丁質(zhì)，有利于幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用，進而增強了轉(zhuǎn) Chi3基因西瓜對真菌的抗性[26-27]。

2.3 耐旱、耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因西瓜

西瓜的種植需要大量的灌溉水，這不利于西瓜在干旱、鹽堿地帶的種植。運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐旱、耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因西瓜的西瓜品種，是西瓜育種中的一個重要方向。Ellul等[28]發(fā)現(xiàn)，將釀酒酵母的耐鹽基因HAL1轉(zhuǎn)入西瓜，可有效提高西瓜對NaCl的耐受能力。Han等[29]將Ca2+/H+的逆向轉(zhuǎn)運蛋白sCAX2B的基因轉(zhuǎn)入用于嫁接西瓜苗的葫蘆砧木中，可增強葫蘆砧木根部對水分和營養(yǎng)鹽的轉(zhuǎn)運能力，從而提高了寄主西瓜苗的接穗率。Kajikawa等[30]發(fā)現(xiàn)生長在沙漠地區(qū)的野生型西瓜比普通的西瓜品種具有更發(fā)達強壯的根系，并且具有優(yōu)越的保水抗旱能力。為此他們建立一套可高效率地對這2種西瓜根系進行基因操作的方法體系，以便對這2種西瓜根系進行對比研究，從而探明該沙漠野生西瓜根系在干旱條件下的生長及保水的分子機制。

3 轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性評價

轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性研究集中在以下2個方面：一是外源基因?qū)ΨN植地環(huán)境安全性的影響。西瓜中轉(zhuǎn)入的外源性基因被認(rèn)為可能轉(zhuǎn)移到土壤中的微生物基因組中，并且存在擴散至種植地周圍的近親植物的風(fēng)險。二是轉(zhuǎn)基因西瓜作為食品時可能對人體產(chǎn)生的危害。Lee等[31]將轉(zhuǎn)基因西瓜的葉子和砧木埋在西瓜田的淺層土壤，觀察隨著植物材料的腐敗降解外源基因的消除過程，并觀察外源基因被土壤微生物捕獲的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源基因在3個月后已完全降解，在這些腐敗的植物材料附近也沒有檢測到含有西瓜外源基因的微生物。Yi等[32]檢測了轉(zhuǎn)基因西瓜根系附近的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，并與非轉(zhuǎn)基因西瓜根系附近的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)作比較，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異，說明并沒有微生物可以獲得西瓜的外源基因而獲得生存優(yōu)勢。然而，值得警惕的是，F(xiàn)uchs等[33]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有病毒外殼基因的南瓜可以將病毒基因轉(zhuǎn)移到野生的近親植物中，他們還認(rèn)為轉(zhuǎn)有多種病毒基因的植物可能會在植株內(nèi)發(fā)生病毒基因的融合和重組，從而產(chǎn)生新的危險病毒。

在轉(zhuǎn)基因西瓜作為食品的安全性問題方面，國內(nèi)外的報道較少。我國學(xué)者應(yīng)奇才等[34]用轉(zhuǎn)WMV-2病毒外殼基因的西瓜飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組小鼠的各項生命體征均無明顯差異，初步表明了該轉(zhuǎn)基因西瓜對小鼠沒有毒性， 屬安全食品。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，轉(zhuǎn)基因西瓜的培育技術(shù)已比較成熟，基因工程應(yīng)用在改良西瓜品種上也取得了許多成功，西瓜轉(zhuǎn)基因的安全問題也有較多的討論。但還有以下兩個問題值得進一步研究：

第一，目前對西瓜轉(zhuǎn)基因的研究主要集中在抗病性等方面，關(guān)于提高西瓜營養(yǎng)水平、耐貯存能力、抗凍能力等方面的研究還少見報道。目前，秋冬季節(jié)市場上還鮮有西瓜出售。若能培育出抗凍的西瓜，使之可以在秋冬季節(jié)和高緯度地區(qū)種植，即可打破西瓜種植的季節(jié)限制和緯度限制；或者提高西瓜的耐貯存能力，延遲西瓜的保藏時間，以滿足大眾在秋冬季節(jié)對西瓜消費的需求。

第二，關(guān)于轉(zhuǎn)基因西瓜的安全問題尤其是作為食品的安全性問題研究得還不多。對于轉(zhuǎn)基因食品，大眾普遍過于憂慮。可以對西瓜的外源基因及其表達的蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的消化和吸收過程進行詳細(xì)的研究，證明它的無害性，從而減輕大眾的憂慮和擔(dān)心。

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