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        麻栗坡兜蘭ISSR引物篩選及反應(yīng)體系的優(yōu)化

        2014-04-29 00:53:32高麗霞
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年20期
        關(guān)鍵詞:體系優(yōu)化

        高麗霞

        摘要 [目的] 對麻栗坡兜蘭ISSR引物進(jìn)行篩選,并建立一個(gè)穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、適合麻栗坡兜蘭ISSR反應(yīng)體系。[方法]以麻栗坡兜蘭DNA為模板,分別對Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反應(yīng)成分進(jìn)行優(yōu)化,并用優(yōu)化的體系對25條蘭科中報(bào)道的ISSR引物進(jìn)行篩選。[結(jié)果]確立了麻栗坡兜蘭最適ISSR-PCR反應(yīng)體系:在25 μl反應(yīng)體系中,Mg2+ 2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5 μl、Taq酶1.4 U。利用該體系,共篩選得到10條ISSR引物用于麻栗坡兜蘭分析,并對21份麻栗坡兜蘭材料進(jìn)行擴(kuò)增,獲得了較好的擴(kuò)增效果。[結(jié)論]該體系穩(wěn)定可靠,為今后ISSR標(biāo)記在兜蘭屬植物的種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性等方面的廣泛應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞 麻栗坡兜蘭;ISSR-PCR;體系優(yōu)化

        中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2014)20-06553-03

        麻栗坡兜蘭(Paphiopedilum malipoense)屬蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum)地生蘭或半附生蘭。麻栗坡兜蘭是兜蘭屬現(xiàn)存種類中最原始的類型,代表了由杓蘭屬向兜蘭屬過渡的種類[1],主要分布于云南東南部、廣西西部、貴州西北部,以及越南北部。一方面由于近年來的過渡采摘,另一方面由于其自身的生物學(xué)原因,它沒有像硬葉兜蘭和杏黃兜蘭那樣延長的地下根狀莖[2],是當(dāng)前最需要保護(hù)的瀕臨物種之一。

        ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已在蘭科中得以廣泛應(yīng)用。趙謙等[3]用14條ISSR引物分析了14個(gè)蝴蝶蘭品種間的遺傳關(guān)系,其多態(tài)百分比為82%,表明蝴蝶蘭品種間存在豐富的遺傳多樣性,并構(gòu)建了ISSR遺傳圖譜;吳振興等[4]用15條ISSR引物對蘭屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析,其多態(tài)百分比為27.2%,并構(gòu)建了ISSR遺傳圖譜;孫小琴等[5]用12條ISSR引物對江西省寒蘭進(jìn)行了遺傳多樣性分析,其多態(tài)百分比為78.9%;馬佳梅等[6]用12條ISSR引物對西雙版納地區(qū)流蘇石斛進(jìn)行遺傳多樣性分析,其多態(tài)百分比為89.74%,表明流蘇石斛品種間存在豐富的遺傳多樣性;嚴(yán)華等[7]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對38種國蘭親緣關(guān)系進(jìn)行分析;沈穎等[8]用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對9種石斛屬植物進(jìn)行品種鑒定分析。但在兜蘭屬的研究中,僅見陳業(yè)等[9]對兜蘭屬親緣關(guān)系的分析,從50條引物中,僅篩選得到6條,對分析遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

        筆者以我國瀕臨物種麻栗坡兜蘭為材料,對影響ISSR擴(kuò)增效果的dNTP、Mg2+、引物、Taq酶以及模板DNA進(jìn)行單因子優(yōu)化試驗(yàn),建立適用于麻栗坡兜蘭的ISSRPCR反應(yīng)體系,利用該體系對從蘭科中檢索到的25條ISSR引物進(jìn)行篩選,為進(jìn)一步研究麻栗坡兜蘭遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試材料為麻栗坡兜蘭,采自木論國家級自然保護(hù)區(qū)的自然居群。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1

        DNA的提取。取新鮮帶葉兜蘭的嫩葉,經(jīng)研磨后,按MURRAY等[10]的CTAB法提取葉片總DNA[10]。

        1.2.2

        ISSR分析。

        ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成,參照高麗等[11],吳振興等[4],嚴(yán)華等[7]以及沈穎等[8]的研究結(jié)果選取其中的25條引物進(jìn)行試驗(yàn),編號(hào)分別為UBC807,UBC811,UBC812,UBC814,UBC817,UBC818,UBC820,UBC822,UBC825,UBC827,UBC829,UBC834,UBC835,UBC836,UBC840,UBC841,UBC855,UBC860,UBC862,UBC864,UBC867,UBC868,UBC880,UBC881,UBC895。

        設(shè)定原始反應(yīng)體系為:25 μl反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.5 μl、dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+3 mmol/L、引物0.4 mmol/L、Taq酶1.4 U、模板DNA 30 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,49 ℃復(fù)性40 s,72 ℃延伸90 s,40個(gè)循環(huán)。最后72 ℃延伸7 min,然后置于4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠,170 V電壓電泳檢測,選取擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

        1.2.3

        ISSRPCR試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對ISSR反應(yīng)體系中的Mg2+、引物、Taq酶、模板DNA、dNTP 5種主要成分進(jìn)行分析(25 μl反應(yīng)體系中各成分優(yōu)化設(shè)計(jì)方案見表1)。

        1.2.4

        引物篩選。取麻栗坡兜蘭DNA樣品用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對25條引物進(jìn)行篩選,選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物。

        1.2.5

        ISSRPCR體系的驗(yàn)證。利用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系,用篩選的引物對21份麻栗坡兜蘭進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增,檢測ISSRPCR擴(kuò)增效率及體系穩(wěn)定性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 初次引物篩選結(jié)果

        將25條引物進(jìn)行初步篩選,引物UBC840擴(kuò)增條帶較理想,因此選擇UBC840進(jìn)行ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。

        2.2 各單因素對擴(kuò)增結(jié)果的影響

        2.2.1

        引物濃度。由圖1可知,引物濃度在0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L時(shí)都有擴(kuò)增,濃度為0.1和0.2 mmol/L時(shí)沒有擴(kuò)增條帶。 引物濃度過低時(shí)PCR產(chǎn)率會(huì)大大降低,甚至不能擴(kuò)增;引物濃度過高時(shí)PCR所擴(kuò)增的條帶變得模糊,還會(huì)產(chǎn)生新的位點(diǎn),非特異性擴(kuò)增增加。因此,引物濃度為0.3 mmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好。

        注:1~8是引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L;9~16是dNTP濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L。

        圖1 不同引物濃度、dNTP濃度的ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果

        2.2.2

        dNTP濃度。dNTP是PCR擴(kuò)增反應(yīng)中磷酸基團(tuán)的主要原料,其濃度對PCR反應(yīng)具有至關(guān)重要的影響,對dNTP 8個(gè)不同濃度進(jìn)行了擴(kuò)增,結(jié)果見圖1。由圖1可知,8個(gè)濃度均能擴(kuò)增條帶,當(dāng)dNTP濃度為0.15 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰,效果最好。

        2.2.3

        Mg2+濃度。Mg2+與dNTP以及模板DNA結(jié)合形成復(fù)合體,才能被Taq酶識(shí)別,其濃度影響Taq酶的活性、精度及產(chǎn)物的特異性,還可影響模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度,引物二聚體的形成等。由圖2可知,8個(gè)不同濃度的Mg2+,除濃度1.0 mmol/L沒有擴(kuò)增條帶外,其他濃度均能擴(kuò)增條帶。濃度為1.5 mmol/L時(shí)只有2條擴(kuò)增條帶,濃度高于2.0 mmol/L時(shí),大片段的非特異性擴(kuò)增帶增多,因此確定2.0 mmol/L為Mg2+的最佳濃度。

        注:1~8 Mg2+濃度分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mmol/L。

        圖2 不同Mg2+濃度的ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果

        2.2.4

        模板DNA。

        模板DNA也是影響ISSRPCR反應(yīng)的因素之一,模板DNA的用量分別為10、20、30、40、50、60、70、80 ng,其每個(gè)梯度都有擴(kuò)增,結(jié)果見圖3。由圖3可知,當(dāng)DNA用量為30 ng時(shí)擴(kuò)增效果較好。

        注:1~8是Taq酶用量分別為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2U;9~16是DNA用量分別為10、20、30、40、50、60、70、80 ng。

        圖3 不同Taq酶用量、DNA用量的ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果

        2.2.5

        TaqDNA聚合酶。Taq酶通過降低反應(yīng)的活化能加快反應(yīng)速度,不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。其用量在PCR反應(yīng)中也是一個(gè)重要的因素,用量過低則不能擴(kuò)增,用量過高又會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增且增加成本。試驗(yàn)設(shè)計(jì)了0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 U 8個(gè)梯度,擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知,在所設(shè)梯度中,擴(kuò)增差異不顯著,因此選0.8 U。

        2.3 麻栗坡兜蘭ISSRPCR最佳反應(yīng)體系

        最終確定木論麻栗坡兜蘭ISSRPCR的最佳反應(yīng)體系為:25 μl體系中含有引物0.3 mmom/L、dNTP0.15 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、模板DNA 30 ng、Taq酶0.8 U、10×PCR Buffer 2.5 μl。

        2.4 引物篩選結(jié)果

        按優(yōu)化后的ISSRPCR最佳反應(yīng)體系對引物進(jìn)行篩選,結(jié)果從25條引物中篩選出10條有擴(kuò)增條帶的引物,其中,引物UBC834、UBC835、UBC840擴(kuò)增條帶最清晰,重復(fù)性最好;其次是引物UBC812、UBC822、UBC841、UBC868、UBC880、UBC881;引物UBC855只有微弱的擴(kuò)增(圖4)。

        2.5 優(yōu)化體系的驗(yàn)證

        利用優(yōu)化出來的體系和篩選出來的引物用于木論麻栗坡兜蘭ISSRPCR反應(yīng),驗(yàn)證該體系的實(shí)用性。選取UBC840和隨機(jī)選取21份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果見圖5。由圖5可知,該體系在各材料中具有較清晰的條帶,且具有豐富的多態(tài)性。

        3 結(jié)論與討論

        DNA模板用量一般對擴(kuò)增結(jié)果影響不大,試驗(yàn)中,ISSR反應(yīng)對模板DNA的用量要求不是特別嚴(yán)格,每個(gè)反應(yīng)梯度都有較好的擴(kuò)增結(jié)果;而適合的引物濃度對PCR產(chǎn)率及多態(tài)性擴(kuò)增都有關(guān)鍵性的影響,該試驗(yàn)過低的引物濃度(0.1、0.2 mmol/L)沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物,過高的引物濃度(0.7、0.8 mmol/L)擴(kuò)增產(chǎn)物不清晰,效率低;Mg2+濃度影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率,其濃度對反應(yīng)影響較大,該研究也證明了這一點(diǎn),當(dāng)濃度低于2 mmol/L時(shí),幾乎沒有擴(kuò)增結(jié)果;相對于反應(yīng)體系中其他成分而言,Taq DNA聚合酶的用量直接決定試驗(yàn)的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性,高濃度Taq DNA聚合酶增加成本和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,低濃度的酶可能使催化能力不夠強(qiáng)而影響產(chǎn)物的合成效率,因此選擇高質(zhì)量的酶是試驗(yàn)開展的首要任務(wù),其合適的用量也是關(guān)鍵。

        該試驗(yàn)通過對影響ISSRPCR反應(yīng)的多個(gè)因素的系列調(diào)整與優(yōu)化,建立了適合麻栗坡兜蘭ISSR分析的PCR反應(yīng)體系,并將這一體系用于21份木論麻栗坡兜蘭進(jìn)行體系驗(yàn)證,結(jié)果證明該體系穩(wěn)定可靠,該體系的成功建立為今后ISSR標(biāo)記在兜蘭屬植物的種植鑒定、遺傳多樣性等方面的廣泛應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn)

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        責(zé)任編輯 李占東 責(zé)任校對 況玲玲

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